星形胶质细胞区室特异性动态的自发钙成像

摘要

来源：Bannai, H., et. al., 利用膜靶向Ca2+指示剂解析培养细胞中的局部Ca2+信号。 J. Vis. Exp. (2019)

该视频通过依次监测定位于质膜和内质网上的钙敏感蛋白，展示了利用荧光成像技术观察星形胶质细胞中特定区室自发性钙动态的过程。

方案

1. Ca²⁺ 成像

1. 记录表达 Lck-RCaMP2 和 OER-GCaMP6f 的星形胶质细胞的自发活动
   注：在没有图像分光光学器件的情况下，可在同一细胞中分别监测质膜和内质网（ER）周围的 Ca²⁺ 信号。本文描述了在同一星形胶质细胞中依次记录 Lck-RCaMP2（靶向质膜的基因编码 Ca²⁺ 指示剂）和 OER-GCaMP6f（靶向外层内质网膜的基因编码 Ca²⁺ 指示剂）的方法。建议使用数值孔径大于 1.3 的油浸物镜以检测自发性 Ca²⁺ 活动。
   1. 在开始记录前至少 30 分钟，打开显微镜、相机、光源和显微镜加热腔。
   2. 将转染了 Lck-RCaMP2 和 OER-GCaMP6f 的细胞爬片装入记录腔室，加入 400 µL 成像培养基，并盖上腔室盖。
   3. 选择适用于 GCaMP6f 的滤光片组和光源（蓝光激发，例如 470–490 nm；参见 材料表），找到表达 OER-GCaMP6f 的星形胶质细胞。
   4. 切换至适用于 RCaMP2 的滤光片组和光源（绿光激发，例如 510–560 nm；参见 材料表），确认同一星形胶质细胞是否表达 Lck-RCaMP2。避免长时间光照以防止光漂白。
   5. 以 2 Hz 的频率连续采集 Lck-RCaMP2 的时间序列图像，持续 2 分钟。将成像数据保存至硬盘（HDD）。
   6. 更换为 GCaMP6f 的滤光片组，在相同视野下以 2 Hz 的频率连续采集 OER-GCaMP6f 的时间序列图像，持续 2 分钟。将数据保存至硬盘（HDD）。
   7. 使用图像分析软件对数据进行分析。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
18毫米直径圆形盖玻片	Karl Hecht "Assistent"	#41001118	厚度1，18毫米直径圆形盖玻片；也可使用其他类型的盖玻片。
显微图像记录用相机			可选用以下相机：制冷CCD相机（例如 Hamamatsu Photonics, OECA-ER）、EM-CCD相机（例如 Hamamatsu Photonics, ImagEM；Andor, iXon）或CMOS相机（例如 Hamamatsu Photonics ORCA-Flash4.0）
图像分析软件			例如 Metamorph（Molecular Devices）、Image J（NIH）和 TI Workbench14（定制开发）
成像介质与缓冲液			根据实验选择合适的介质或缓冲液。使用培养基时，建议选用不含酚红的培养基以减少背景荧光。添加20 mM HEPES以在非二氧化碳培养箱环境中维持pH值。
倒置荧光显微镜			例如 IX73（Olympus）或 Eclipse TI（Nikon Instech）
用于GCaMP6f成像的显微镜滤光片组			适用于GFP的滤光片组（激发光波长：480 ± 10 nm；发射光波长：530 ± 20 nm）
用于RCaMP2成像的显微镜滤光片组			适用于RFP的滤光片组（激发光波长：535 ± 50 nm；发射光波长：590 nm长通）
显微镜加热系统			用于在成像过程中将细胞维持在37°C。为避免因热膨胀引起的漂移，建议使用覆盖整个显微镜本体的加热系统（例如 Tokai Hit, Thermobox）。
显微镜激发光源			汞灯（100 W）、氙灯（75 W）、发光二极管（LED）照明系统（例如 CoolLED Ltd., precisExcite；Thorlabs Inc., 4-Wavelength LED Source；Lumencor, SPECTRA X light engine）。若使用汞灯或氙灯，应使用ND滤光片以降低激发光强度。
显微镜物镜			建议使用数值孔径高于1.3的平场复消色差油浸物镜，用于记录神经元和星形胶质细胞中的自发性Ca²⁺活动。
记录用培养室	Elveflow	Ludin Chamber	该记录培养室适用于18毫米直径圆形盖玻片。
体视显微镜			用于海马组织解剖。可使用Olympus SZ60或同等性能的体视显微镜。