星形胶质细胞中室特异性动力学的自发钙成像

摘要

资料来源：Bannai， H.， et al.， Dissection of local Ca2+ signals in Culted Cells in Membrane-targeted Ca2+ Indicators.J. Vis. Exp. （2019年）

该视频演示了荧光成像，通过顺序监测位于质膜和内质网上的钙敏感蛋白来观察星形胶质细胞中隔室特异性的自发钙动力学。

方案

1. Ca²⁺ 成像

1. 记录表达 Lck-RCaMP2 和 OER-GCaMP6f/
   的星形胶质细胞的自发活动注意：如果没有图像分裂光学器件，可以在同一细胞中监测质膜和内质网 （ER） 周围的 Ca²⁺ 信号。在这里，描述了Lck-RCaMP2（质膜靶向基因编码Ca²⁺指示剂）和OER-GCaMP6f（外质网膜靶向遗传编码Ca²⁺指示剂）在同一星形胶质细胞中的顺序记录。强烈建议使用数值孔径大于 1.3 的油浸物镜来自发 Ca²⁺ 活性。
   1. 记录前打开显微镜、相机、光源和显微镜加热室至少 30 分钟。
   将
   2. 含有用 Lck-RCaMP2 和 OER-GCaMP6f 转染的细胞的盖玻片安装在记录室中，并加入 400 μL 成像培养基。在腔室顶部盖上盖子。
   3. 选择GCaMP6f的滤光片组和光源（蓝色激发光，例如470-490 nm;参见 材料表）。找到表达OER-GCaMP6f的星形胶质细胞。
   4. 选择 RCaMP2 的滤光片组和光源（绿色激发光，例如 510–560 nm;参见 材料表），并确认 Lck-RCaMP2 是否在同一星形胶质细胞中表达。避免长时间暴露在光源下，以防止光漂白。
   以
   5. 2 Hz 记录 Lck-RCaMP2 的延时图像 2 分钟。将成像数据保存在 HDD 上。
   6. 将过滤器集更改为 GCaMP6f 的过滤器。以 2 Hz 在同一视场中记录 OER-GCaMP6f 的延时图像 2 分钟。将数据保存在硬盘上。
   7. 使用图像分析软件分析数据。

材料