We describe the enzyme-linked lectin assay (ELLA) for measuring influenza neuraminidase (NA)-inhibition antibody titers in sera. The assay uses peanut agglutinin to quantify galactose residues that become accessible when NA removes sialic acid from fetuin-coated, 96-well plates.
Antikroppar mot neuraminidas (NA), den näst mest förekommande ytprotein på influensavirus, bidrar mot skydd mot influensa. Traditionella metoder för att mäta NA inhibering (NI) antikroppstitrar är inte praktiska för rutinmässig serologi. Detta protokoll beskriver enzymbunden lektin assay (ELLA), ett praktiskt alternativ metod för att mäta NI titrar som utförs i 96-brunnars plattor belagda med ett stort glykoprotein substrat, fetuin. NA klyver terminal sialinsyror från fetuin, utsätta den näst sista socker, galaktos. Jordnötsagglutinin (PNA) är ett lektin med specificitet för galaktos och därför omfattningen av desialylering kan kvantifieras med användning av en PNA-pepparrotsperoxidaskonjugat, följt av tillsats av ett kromogent peroxidassubstrat. Den optiska densiteten som mäts är proportionell till NA-aktivitet. För att mäta NI antikroppstitrar är serieutspädningar av sera inkuberas vid 37 ° CO / N på fetuin-belagda plattor med ett fast belopp of NA. Det reciproka värdet av den högsta serumspädning som resulterar i ≥50% inhibering av NA-aktivitet betecknas som NI-antikroppstiter. Ella ger en praktisk format för rutin utvärdering av svaren mänskliga antikropps efter influensainfektion eller vaccination.
Neuraminidas (NA) är ett glykoprotein uttryckt på ytan av influensavirioner. Dess enzymaktivitet är nödvändig för frisättningen av nybildade viruspartiklar från infekterade celler 1,2. Antikroppar som hämmar NA aktivitet minskar virustitrar och sjukdomssymptom i djurmodeller 3 och korrelerar med resistens mot sjukdomar hos människor 4. En ökning av NA-hämning (NI) titrar efter vaccination kan därför tjäna en indikator på vaccinets effektivitet, men många tidigare influensa immunogenicitetsstudier inte innehöll denna effekt eftersom de traditionella analysen för att mäta NI antikroppstitrar är opraktiskt för rutinmässig serologi.
Den traditionella metoden för att mäta NI titrar är baserad på kvantifiering av mängden av sialinsyra som klyvs från glykokonjugat av NA 1. Denna metod, som ofta kallas syran (TBA) -metoden thiobarbituric, använder farliga kemikalier för att omvandla sialic acid till en kromofor som kan kvantifieras genom spektrometri. Analysen är inte lämplig för att testa ett stort antal prover, eftersom individuella glas rör används, vilket gör analysen besvärligt. Miniatyrisering av analysen till en 96 brunnars plattor ger en mer praktiskt format 5 emellertid denna analys kräver fortfarande användningen av giftiga kemikalier och därför är inte idealisk.
En alternativ analys för att mäta NI antikroppstitrar utvecklades av Lambré et al. 6. Denna analys kvantifierar enzymaktivitet genom att mäta mängden av den näst sista socker av glykoproteiner, galaktos, som exponeras när sialinsyra släpps av NA. Eftersom jordnöt-agglutinin (PNA) binder specifikt till galaktos, kan en PNA-pepparrotsperoxidas (HRPO) -konjugat användas för att erhålla en kolorimetrisk avläsning. Den optiska densiteten som mäts är alltså proportionellt till NA-aktivitet i provet. NI titrar mäts genom att bestämma den högsta spädningenav serum som inhiberar åtminstone 50% av NA-aktivitet. Denna enzymkopplad lektin assay (ELLA) utförs i 96-brunnars plattor belagda med fetuin, ett starkt glykosylerat serumprotein, som substrat för NA.
En viktig faktor för analyser som mäter NI titer, är källan till NA. Detta beror på att serum från vaccinerade eller infekterade individer innehåller antikroppar mot hemagglutinin (HA) samt antikroppar mot NA. Antikroppar som binder till HA kan störa NA-aktivitet och därför, för att undvika icke-specifik inhibering av HA-specifika antikroppar, renade NA eller helvirus innehållande ett antigeniskt inkompatibla HA bör användas i analysen. Dessa virus kan alstras genom klassiska reassortment eller genom omvänd genetik; Målet är att rädda ett virus som innehåller HA av en subtyp som inte är relaterad till målet stammen, och NA av viruset som studeras. Analysen beskrivs i denna artikel använder influensa A-virus som genereras av reverse genetik att innehålla HA av subtyp H6 och riktade NA från influensa A-virus, subtyp H1N1 och H3N2 5.
Resultat som genereras av Ella och miniatyriserade TBA analyser visar dessa metoder är jämförbara med liknande subtyp specificitet och sensitivitet 7. ELLA inte kräver användning av farliga kemikalier och är därför den lämpligaste metoden för att mäta NI titer. Det är lätt att utföra, med bara några få steg (Figur 1): prover späds och överförs till en fetuin-belagda plattan till vilket virus (källan till NA) tillsätts. Plattan inkuberas O / N och tvättades före tillsats av PNA-HRPO. Efter en 2 timmars inkubering tvättas plattan och peroxidassubstrat tillsätts; färgreaktionen stoppas och slutligen den optiska densiteten mäts och det reciproka värdet av provspädning som resulterade i minst 50% inhibering av NA aktivitet rapporteras som den 50% slutpunkten titer. En intra-laboratoriestudie för att utvärdera reproducibility av Ella, visade att platta till platta variationen är minimal och operatör till operatör repeterbarhet resulterade i högst två-faldiga skillnader i titer 7. En efterföljande interlaboratoriestudie av ELLA variabilitet visade att analysen har god reproducerbarhet när de utförs i olika laboratorier och införandet av ett standard kan ytterligare minska variationen i resultat 8. Ella är lämplig för mätning av NI antikroppstitrar i paneler serum från prekliniska och kliniska influensavaccin studier 7 och kan även användas för att utvärdera antigena skillnader mellan kontoren av influensavirus 9.
Enzyme-linked lektin-analysen är en praktisk metod för att mäta NI antikroppstitrarna i sera. Även ELLA beskrevs av Lambre et al., 1990, har sitt godkännande som standard serologisk analys varit senare, med många laboratorier som utför analysen för att mäta NI titrar av kliniska prover 12-16 antikroppar. Vissa modifieringar kan göras för att protokollsteg utan en stor inverkan på de NI titrar som mäts. Till exempel kan PBS användas som spädningsmedel, men det är mycket bra att jämföra virus titreringskurvor i den rekommenderade buffert (MES, pH 6,5) och PBS innan ett beslut fattas, eftersom vissa NA subtyper har minskat avsevärt enzymaktivitet vid pH> 7,0. När det optimala pH-värdet inte används, kan den maximala signalen av virus minskas, vilket resulterar i användningen av en överdriven mängd av antigen (dvs, virus) i analysen; under dessa förhållanden kan analysen ha reducerad känslighet.
några ingenn-specifik hämning observeras när obehandlat sera testas i ELLA. Detta avlägsnas genom värmebehandling (56 ° C under 45 min), vilket indikerar närvaron av termolabila p-hämmare. Andra icke-specifika inhibitorer (α och γ-klass) av influensa HA har beskrivits, särskilt i förhållande till H3N2-virus hemagglutination och smittsamhet. Faktum är att icke-specifik hämning också observerats i ELLA när H3N2 virus används som källa för NA; denna inhibering avlägsnas genom behandling av serumproverna med en liten mängd sialidas 9.
Liksom för andra serologiska tester bör negativa och positiva kontroller inkluderas i varje analys för att tillhandahålla ett medel för att utvärdera analysprestanda. När analysen inte har uppfyllt acceptanskriterier, ska orsaken identifieras. Tabell 1 innehåller en lista över potentiella steg i analysen som kan tas upp för att felsöka problem.
Den ELLA-protokollet provIDed i denna rapport använder reassortant virus som innehåller HA härrör från en fågelviruset, som källa till NA. Detta utgör en begränsning att utföra analysen, eftersom ett tillstånd som krävs för att arbeta med lågpatogena fågelvirus. H6Nx reassortant virus kan delas mellan laboratorier efter att de har inaktiverats. Därför analysen kan utföras genom samarbete när laboratorium genererar reassortant virus har visat att inaktiveringen är slutförd och förberedelser har behållit sin NA-aktivitet. Begränsningen att använda H6Nx reassortant virus kan övervinnas genom användning av icke-smittkällor NA. Till exempel har vissa laboratorier används renat rekombinant NA 17, medan andra har använt viruslika partiklar (VLP) 15. Varken rekombinant NA eller VLP är lätt tillgängliga och därför fortsätter vi att använda influensavirus med en antigen-inkompatibla avian HA.
den traditionellametod för att mäta NI antikroppstitrar är inte praktiskt av flera skäl; de flesta oro är de skadliga kemikalier som behövs för att producera en färgreaktion. Dessutom är stora volymer av prov som krävs och analysen är besvärlig att utföra. I motsats till detta är ELLA enkel att utföra och är i ett format som gör att titrering av ett rimligt antal prover. Data från studier som undersökt ELLA variation visar att analys ger reproducerbara resultat 7,8. Ella har därför gjort rutinmätning av titer möjliga NI antikropp, och det förväntas att det kommer att användas oftare av laboratorier som utför serologiska studier.
Det finns flera viktiga steg som måste beaktas när man utför Ella. För det första måste icke-specifika hämmare av NA-aktivitet tas bort. Dessa inhibitorer är i allmänhet termolabila och förstörs genom värmebehandling vid 56 ° C under 45 minuter. Värmebehandling är tillräcklig för att avlägsna icke-specific inhibitorer från prover när H6 reassortant virus används som källa för NA, men när H3N2-virus används i ELLA, serumfaktorer som binder till hemagglutinin interfererar också med ELLA och bör tas bort genom behandling med en liten mängd sialidas före värmebehandling 9. För det andra, en överdriven mängd av antigen, det vill säga, reassortant H6Nx virus, bör inte användas eftersom detta minskar analysens känslighet. Noggrann titrering av virus är därför ett viktigt steg; mängden antigen som används i varje analys måste ge en signal som är väl över bakgrunden, och måste vara inom det linjära området av titreringskurvan, dvs måste signalen (optisk densitet) vara proportionell mot virusutspädning.
Förutom den rutinmässiga serologi kan ELLA användas för att utvärdera antigena skillnader mellan NAS i säsongsinfluensavirus. Denna information kan vara till stor hjälp när man väljer virusstammar för inkludering ens vaccinkandidater och kommer att underlätta en större förståelse för immun tryck som resulterar i antigendrift av NA. Dessutom kan antigen analys NAS från svin eller aviära influensavirus ge viktig information för att avgöra pandemin potential av nya stammar.
The authors have nothing to disclose.
This project was funded by intramural PanFlu funds from the Center for Biologics Evaluation and Research (CBER). Plasmids used to prepare reassortant viruses were kindly provided by Robert Webster, St Jude Children’s Research Hosptial, Memphis, TN. We are indebted to Ewan Plant and Haruhiko Murata for critical review of the manuscript.
coating buffer | KPL | 50-84-01 |
fetuin | Sigma | F3385 |
5X MES, pH 6.5 | KD-Medical | PBS-0134 |
CaCl2 | Sigma | C7902 |
30% BSA | Sigma | A8327 |
Tween 20 | Sigma | P1379 |
Lectin PNA-HRPO | Sigma | L7759 |
PBS-T | Sigma | P3563-10PAK |
o-Phenylenediamine dihydrochloride | Sigma | P8287 |
phosphate-citrate buffer | Sigma | P4922 |
Sulfuric acid | Sigma | 258105 |
96-well Maxisorp plates | NUNC | 439454 |
96-well round bottom well plates | NUNC | 267245 |
Plate sealers | Thermo Scientific | 14-245-192B |
chicken eggs | Charles River Laboratories | 9 day old embryonated specific pathogen free (SPF) chicken eggs |
multichannel pipette | Variety of suppliers e.g., Rainin, Eppendorf | 8 or 12 channel manual pipettem 50-250 µl volume |
Pipette tips | Depends on pipettor brand | Depends on pipettor brand |
Plate reader, with 490 nm filter | Perkin Elmer | Victor V |
water bath set to 37 °C | Variety of suppliers | Variety of models |
water bath set to 56 °C | Variety of suppliers | Variety of models |
refrigerator set to 4 °C | Variety of suppliers | Variety of models |
incubator set to 37 °C | Variety of suppliers | Variety of models |