Dieses Protokoll beschreibt die Beseitigung und Reinigung der Lungenarterie endothelialen Zellen (PAECs), die sich zu den Ballon-Tipps von Swan-Ganz Katheter halten, während sie während rechts Herzkatheter in der Lungenarterie eingeklemmt sind und bleiben an der Luftballon nach Entnahme aus dem Körper des Patienten.
Eine Vielzahl von Krankheiten führen, pulmonale Hypertonie (PH), definiert als eine mittlere Lungenarterie Druck von mehr als 25 MmHg in Ruhe. Zur weiteren diagnose und PH zu verwalten, werden Patienten wiederholt Rechte Herz Katheterwechsel (RHC) wobei ein Swan-Ganz-Katheter ist in eine Filiale der Lungenarterie fortgeschritten und ein Ballon aufgeblasen wird, um die Katheterspitze Keil unterzogen. Dieser Artikel beschreibt ein Protokoll, wobei Lungenarterie endothelialen Zellen (PAECs) von Sprechblasentipps Swan-Ganz Katheter nach RHC geerntet und mit einer Anti-CD146 Affinität Spalte Technik, vermeintliche PAECs zu reinigen gereinigt werden können. Diese Zellen können verwendet werden, um eine in-situ Momentaufnahme der biologische Zustand der pulmonalen Gefäßsystems Endothel, hämodynamische Messungen während RHC zu ergänzen. Geerntet und gereinigten PAECs verwendet werden, für die entweder Zellkultur oder für nachfolgende analytische Tests wie Fluss Cytometery.
Aktuelle US-amerikanischen und europäischen Richtlinien erfordern richtige Herzkatheter zur Diagnostik der pulmonalen Hypertonie1. Ärzte und Wissenschaftler, die versuchen, diese Krankheit zu verstehen den Wunsch biologischer Proben aus der pulmonalen Gefäßsystem der hämodynamischen Daten ergänzen, die während der RHC erfasst werden. Leider das Risiko bei pulmonalen vaskulären Biopsie ist sehr hoch, und biologische Proben des pulmonalen Gefäßsystems sind daher nur selten wenn überhaupt von lebenden Patienten RHC erhalten. Während viel von Erkenntnis pulmonalen Gefäßgewebe von cadaveric oder explantiert Lungen, diese Beispiele sind nicht in der Lage, die Biologie des Krankheitsprozesses PH zu reflektieren, wie es bei einem lebenden Patienten abspielt. Im Jahr 2013 berichteten wir erstmals, dass Lungenarterie endothelialen Zellen (PAECs) von den Ästen der Lungenarterie durch physischen Kontakt mit der QuickInfo-Sprechblase des Swan-Ganz-Katheters während RHC entblößt sind und in kleinen Stückzahlen aus dem Katheterspitzen zurückgewonnen werden nach dem Verfahren2.
Dieser Artikel veranschaulicht unsere Technik für die Beseitigung und Reinigung der Lungenarterie endothelialen Zellen (PAECs) von Sprechblasentipps Swan-Ganz Katheter nach rechts Herzkatheter. Bisher, wurde die Methodik für die Durchführung dieser Ernte-Technik nicht ausreichend detailliert in der Literatur um einheitliche Ergebnisse zwischen Laboratorien, die Durchführung der Technik gewährleisten beschrieben. Dieser Artikel soll diesen Mangel mit visualisierten Demonstration der Technik, von am Krankenbett Sammlung von Katheterspitzen bis zum fertigen Produkt von gereinigten CD146 + Endothelzellen zu überwinden. Diese Technik sollte Hilfe bei der Förderung der Forschung in der Pathobiologie der verschiedenen Ätiologien von PH und möglicherweise führen zur Entwicklung von neuen diagnostischen Assays hämodynamische während RHC gesammelten Daten ergänzen.
Die Bedeutung dieser Technik auf dem Gebiet der pulmonalen vaskulären Medizin und Forschung ist, dass es ermöglicht den Zugriff auf eine Momentaufnahme der Biologie der pulmonalen Endothel in Situ und im Gegensatz zu früheren Studien auf explantiert oder cadaveric Lungen, stellt keine einen Endpunkt für das Thema Lunge. Vor kurzem haben wir gezeigt, dass eine Anti-apoptotische Biomarker in diesen Zellen Nützlichkeit in genauer Phänotypisierung kann im Zusammenhang mit Sorten von pulmonaler Hypertonie3. Die Ausbeute an Zellen gewonnen ist relativ klein, ~ 5, 000-25.000 PAECs pro Probe, und diese Zellen sind schwierig (aber nicht unmöglich), Kultur. Wir glauben, dass clevere Kliniker und Forscher Synergien zwischen diesen Begleiter Techniken finden um pulmonalen vaskulären Forschung, Diagnostik und Vorzeichen zu fördern.
In diesem Artikel beschriebene Verfahren wird am besten im Rahmen der bisherigen experimentellen Paradigmen für das Studium der pulmonalen Gefäßendothels geschätzt. Frühere Versuche, PAECs von Menschen zu erhalten wurden beschränkt explantiert/cadaveric Lunge5 und einem kurzlebigen Versuch, einen Katheter in der Lage, Lungenarterie Biopsie6zu entwickeln. Wie in den letzten Beitrag7erwähnt, ist die gegenwärtige Technik durch seine Fähigkeit PAECs von menschliche Leben zu erhalten, und zwar an mehreren Zeitpunkten in der Progression der Krankheit und/oder Therapie von Lungenkrebs Gewebe Ernte auszeichnet. Allerdings ist darauf hinzuweisen, dass eine Begleiter-Technik vor kurzem berichtet hat wobei induzierte pluripotente Stammzellen (IPSCs) Transdifferentiated in PAECs4,5sein kann. Diese Technik produziert reichliche Kulturen der Patienten-spezifischen PAECs und ermöglicht die Studie über die Auswirkungen des Patienten-spezifischen genetischen Hintergrund auf PAEC Biologie. Trotz dieser Vorteile können nicht diese IPSC abgeleitet PAECs keine Informationen über die Interaktion zwischen lokalen Mikroumgebung und Patienten-spezifischen genetischen Hintergrund bieten. Unsere Fraktion hat die Ansicht dargestellt, dass “Cath Tip” und IPSC-Techniken bei der Förderung der Feld8synergistische sein dürften.
In dieser gegenwärtigen und historischen Kontext die Grenzen dieser Technik hingewiesen. Erstens ist es wichtig zu beachten, dass die Erträge der PAECs abgeleitet von dieser Methode erheblich variieren können. Vermutlich tragen Patienten-Arzt-bundeslandspezifischen Krankheitsfaktoren zu dieser Variabilität, wie das Protokoll keine Schritte enthält, die zu großen Verlust des Quellmaterials führen zu erwarten wäre. Tabelle 1 zeigt Vertreter, die CD146 + ergibt sich aus einer Vielzahl von PAEC ernten Nutzung Katheterspitzen, gewonnen aus einer Vielzahl von Patienten mit verschiedenen Krankheitszuständen der pulmonalen Hypertonie und eine Vielzahl von Arzt-Betreiber. Zweitens Zelle Erträge sind insgesamt gering und ihre Lebensfähigkeit für Kultur erweist sich noch tiefer in unseren Händen. Während wir früher Kulturen der PAECs mit dieser Methode1gewachsen sind, wir übernehmen diese Ergebnisse stellen Rettung einer Teilmenge von Progenitorzellen nach Absterben der meisten der Probe und ist nur zeitweise erfolgreich in unseren Händen. Beispielsweise ist es nicht ungewöhnlich, am Morgen nach eine Ernte vergoldet wurden nur ein paar Dutzend Anhänger PAECs in Kultur zu finden. Diese Mikro-Kulturen überleben oft nicht auf Expansion. Zur Optimierung dieses Protokolls in einer Weise, die die Lebensfähigkeit der PAECs aufrechterhalten wird und ihre Bedingungen in der Kultur, das angestrebten Ziel der Vermehrung der patientenspezifischen PAEC Ernten zu erreichen, sind weitere Arbeiten erforderlich. Zu guter Letzt kann der CD146 positive Selektion, die, den wir angepasst haben, Verunreinigungen mit anderen CD146 + Zellen, wie z. B. die zirkulierenden endothelialen Zellen4, Perizyten, glatten Muskelzellen und seltene CD146 + T Zellen9,10nicht ausschließen. Dennoch, diese Zellen gelten als sehr gering an Zahl in auf diese Weise gesammelten Proben und CD146 ist für dieses Protokoll wesentlich genauer als andere Zelle Marker der Endothelzellen wie CD31 (die auch auf eine Vielzahl von Blut übertragbare vorhanden ist Zellen, einschließlich der Thrombozyten-11). Alle zukünftigen Verbesserungen zur Verbesserung der Spezifität sollten gegen ihre potenziell negativen Einfluss auf Ertrag ausgeglichen werden.
The authors have nothing to disclose.
Die Autoren möchten danken die Ärzten und support-Mitarbeiter von der fortgeschrittenen Herzinsuffizienz und pulmonale Hypertonie Service des Allegheny General Hospital für die Bereitstellung von Hunderten von Katheter Proben über mehrere Jahre, das erleichtert die Optimierung dieser Methodik.
100mm culture dish | Fisher | NC9385690 | |
15 mL Centrifuge Tubes | Midsci | C15R | |
16% Formaldehyde | Fisher | PI28908 | |
50 mL centrifuge tubes | Midsci | C50R | |
Accutase | Thermo | A1110501 | cell detachment solution |
Cell Scraper | Fisher | 08-100-241 | |
Endothelial Cell Growth media | Cell Applications | 211-500 | |
Forceps | any | ||
Hemostat | any | ||
LoBind microfuge tube | Fisher | 13-698-794 | |
Miltenyi CD146 beads | Miltenyi | 130-093-596 | |
Miltenyi FCR blocker | Miltenyi | 130-059-901 | |
Miltenyi LS columns | Miltenyi | 130-042-401 | |
Miltenyi magnet | Miltenyi | MidiMACS | |
Miltenyi RBC lysis buffer | Miltenyi | 130-094-183 | |
PBS | Fisher | BP2438-4 | |
Scissors | any | ||
Syringes | BD | 309597 |