Det här protokollet beskriver borttransport och rening av lungartären endotelceller (PAECs) som följer ballong tips av Swan-Ganz katetrar medan de är inklämd i lungartären under höger hjärtkateterisering och förbli vidhäftat till den deflaterat ballong efter borttagning från patientens kropp.
En mängd olika patologier leda till pulmonell hypertension (PH), som definieras som en genomsnittlig lungartärtryck överstiger 25 mmHg vid vila. För att ytterligare diagnostisera och hantera PH, genomgå patienter upprepade rätt hjärta catheterizations (RHC) vari en Swan-Ganz kateter är avancerade in en gren av lungartären och en ballongen är fylld för att kila kateterspetsen. Denna artikel visar ett protokoll där lungpulsådern endotelceller (PAECs) kan skördas från ballong tips av Swan-Ganz katetrar efter RHC, och renas med en anti-CD146 affinitet kolumn teknik att rena förmodade PAECs. Dessa celler kan användas för att ge en jordbaserad ögonblicksbild av biologiska tillståndet för pulmonell kärlsystemet endotelet att komplettera hemodynamiska mätningar erhållits under RHC. Skördas och renade PAECs kan användas för antingen cellkultur eller för efterföljande analytisk analyser såsom flöde cytometery.
Aktuella amerikanska och Europeiska riktlinjer kräver rätt hjärtkateterisering för diagnostik av pulmonell hypertension1. Läkare och forskare försöka förstå denna sjukdom lust biologiska prover från den pulmonell kärlsystemet att komplettera de hemodynamiska data som samlas in under RHC. Tyvärr, riskerna med pulmonell vaskulär biopsi är mycket hög, och därför biologiska prover för att pulmonell kärlsystemet är sällan om någonsin erhållits från levande patienter som genomgår RHC. Medan mycket insikt har vunnits från pulmonell kärlvävnad från avlidna eller explanterad lungorna, dessa prover är inte kan reflektera biologi PH sjukdomsprocessen som det utspelas i en levande patient. Under 2013 rapporterade vi först att lungpulsådern endotelceller (PAECs) är utblottad från grenar av lungartären genom fysisk kontakt med ballong spets den Swan-Ganz katetern under RHC och kan återvinnas i litet numrerar från katetern tips efter den procedur2.
Denna artikel illustrerar vår teknik för borttransport och rening av lungartären endotelceller (PAECs) från ballong tips av Swan-Ganz katetrar efter höger hjärtkateterisering. Hittills, har metoden för att utföra denna skörd teknik beskrivits tillräckligt ingående i litteraturen att säkerställa enhetliga resultat mellan laboratorier som utför tekniken. Denna artikel syftar till att övervinna denna brist, erbjuder visualiserade demonstration av tekniken, från sängkanten samling av katetern tips till den slutliga produkten av renat CD146 + endotelceller. Denna teknik bör stöd främja forskning i patobiologi av olika etiologier av PH och möjligen resultera i utveckling av nya diagnostiska analyser att komplettera hemodynamiska data som samlats in under RHC.
Vikten av denna teknik till fältet för pulmonell vaskulär medicin och forskning är att det ger tillgång till en ögonblicksbild av biologin av pulmonell endotelet i situ och i motsats till tidigare studier på explanterad eller avlidna lungorna, representerar inte en slutpunkt för försökspersonens lung. Nyligen har vi visat att ett anti-apoptotiska biomarkör i dessa celler kan ha användbarhet i mer exakt fenotypning med sorter av pulmonell hypertension3. Utbytet av celler som erhållits är relativt små, ~ 5, 000-25 000 PAECs per prov, och dessa celler är svårt (men inte omöjligt) att kultur. Vi tror att smarta kliniker och forskare hittar synergier mellan dessa följeslagare tekniker för att avancera pulmonell vaskulär forskning, diagnostik och prognostisering.
Tekniken som beskrivs i denna artikel är bäst uppskattas i samband med tidigare experimentella paradigm för att studera den pulmonella vaskulära endotelet. Tidigare försök att få PAECs från människor begränsats till explanterad/avlidna lungorna5 och ett kortvarigt försök att utveckla en kateter som är kapabel av lungartären biopsi6. Som påpekas i en senaste granskning7, är den nuvarande tekniken distingerad från lunga vävnad skörd genom dess förmåga att få PAECs från en levande människa, och att göra det vid flera tidpunkter i förloppet av sjukdomen eller behandlingen. Det bör dock noteras att en kamrat teknik har nyligen rapporterats whereby inducerade pluripotenta stamceller (IPSCs) kan vara transdifferentiated i PAECs4,5. Denna teknik ger riklig kulturer av patient-specifika PAECs och tillåter studier av effekterna av patient-specifika genetiska bakgrunden på PAEC biologi. Trots dessa fördelar, kan inte dessa IPSC-derived PAECs erbjuda någon information om samspelet mellan lokala närmiljön och patientspecifika genetisk bakgrund. Vår egen grupp har lagt fram anser att de ”cath spets” och IPSC tekniker är sannolikt att vara synergistisk framåt i fält8.
Begränsningarna i denna teknik bör noteras i detta nuvarande och historiska sammanhang. Först, är det viktigt att notera att avkastning av PAECs härrör från denna metod kan variera avsevärt. Förmodligen, patient-, sjukdom stat – och läkare-specifika faktorer bidra till denna variation, eftersom protokollet inte innehåller steg som skulle förväntas leda till betydande förlust av källmaterial. Tabell 1 visar representant CD146 + avkastning från en mängd PAEC skördar utnyttja katetern tips från en mängd patienter med olika sjukdomstillstånd av pulmonell hypertension och en mängd läkare operatörer. Andra, cell avkastningen är allmänt låg, och deras livskraft för kultur har visat sig vara lägre än i våra händer. Medan vi har tidigare vuxit kulturer av PAECs som använder denna metod1, vi tar dessa resultat representerar räddning av en delmängd av stamceller efter die-off av mest av provet och lyckas bara periodvis i våra händer. Det är till exempel inte ovanligt att hitta bara ett par dussin anhängare PAECs i kultur morgonen efter en skörd har varit klädd. Ofta överlever inte dessa mikro-kulturer till expansion. Det krävs ytterligare arbete för att optimera detta protokoll på ett sätt som kommer att upprätthålla lönsamheten för PAECs och deras villkor i kultur att nå det önskade målet av förökningen av patientspecifika PAEC skördar. Slutligen utesluta CD146 positiva val har vi anpassat inte kontamination med andra CD146 + celler, såsom cirkulerande endotelceller4, pericyter, glatta muskelceller och sällsynta CD146 + T celler9,10. Ändå, dessa celler antas vara mycket få till antalet i prov som samlats på detta sätt, och CD146 är betydligt mer specifik för detta protokoll än andra cell markörer av endothelial celler såsom CD31 (som är också närvarande på en mängd blodburna celler inklusive blodplättar11). Eventuella framtida förbättringar som syftar till att förbättra specificitet bör vägas mot deras potentiellt negativa inverkan på avkastningen.
The authors have nothing to disclose.
Författarna vill tacka läkarna och stödpersonal i tjänsten avancerad hjärtsvikt och Pulmonell Hypertension av Allegheny General Hospital för tillhandahållande av hundratals katetern prover under flera år som har underlättat den optimering av denna metod.
100mm culture dish | Fisher | NC9385690 | |
15 mL Centrifuge Tubes | Midsci | C15R | |
16% Formaldehyde | Fisher | PI28908 | |
50 mL centrifuge tubes | Midsci | C50R | |
Accutase | Thermo | A1110501 | cell detachment solution |
Cell Scraper | Fisher | 08-100-241 | |
Endothelial Cell Growth media | Cell Applications | 211-500 | |
Forceps | any | ||
Hemostat | any | ||
LoBind microfuge tube | Fisher | 13-698-794 | |
Miltenyi CD146 beads | Miltenyi | 130-093-596 | |
Miltenyi FCR blocker | Miltenyi | 130-059-901 | |
Miltenyi LS columns | Miltenyi | 130-042-401 | |
Miltenyi magnet | Miltenyi | MidiMACS | |
Miltenyi RBC lysis buffer | Miltenyi | 130-094-183 | |
PBS | Fisher | BP2438-4 | |
Scissors | any | ||
Syringes | BD | 309597 |