פרוטוקול זה מתווה את שיטת הקלטת כיצד לבנות באופן ידני מיקרו-מערך רקמות באמצעות בלוקים של תורמי FFPE בעומקים שונים.
מיקרו-מערך הרקמות (TMA) הוא כלי מחקר חשוב שבו ניתן לייצג דגימות רבות של פרפין קבוע פורמלין (FFPE) בבלוק פרפין יחיד. זה מושג על ידי שימוש בליבות רקמה המופקות מאזור העניין של בלוקי FFPE שונים של תורמים וסידורם לבלוק פרפין TMA יחיד. לאחר בנייתם, ניתן להשתמש בקטעים מה-TMA שהושלם כדי לבצע אימונוהיסטוכימיה, כרומוגניות, פלואורסצנציה בהכלאה באתרה (FISH) ומחקרי RNA ISH להערכת ביטוי חלבונים, כמו גם שינויים גנומיים ושעתוק בדגימות רבות בו זמנית, ובכך למזער את השימוש ברקמות ולהפחית את עלויות הריאגנטים. ישנן מספר טכניקות שונות לבניית TMA. אחת משיטות הבנייה הנפוצות ביותר היא שיטת הנמען, שעובדת בצורה הטובה ביותר עם ליבות באותו אורך שעבורן מומלץ אורך מינימלי של 4 מ”מ. למרבה הצער, ניתן לכרות בכבדות בלוקי רקמות במהלך תהליך האבחון, מה שמביא לעתים קרובות לעובי בלוקים “לא אידיאליים” של פחות מ-4 מ”מ. המאמר והסרטון הנוכחיים מתמקדים בשיטת סרט הדבקה הדו-צדדי; שיטה ידנית חלופית, זולה, קלה לשימוש ומהירה לבניית TMAs בצפיפות נמוכה (<50 ליבות) התואמת מאוד לבלוקים אלה של תורמים שאינם אידיאליים. פרוטוקול זה מספק מדריך שלב אחר שלב כיצד לבנות TMA בשיטה זו, תוך התמקדות בחשיבות הקריטית של סקירה פתולוגית ואימות לאחר בנייה.
רקמות מוטבעות פרפין קבועות פורמלין (FFPE) נמצאות בשימוש נרחב במחקרי ביטוי חלבונים מורפולוגיים ואימונוהיסטוכימיים1. עם זאת, מחקר גילוי דורש לעתים קרובות בדיקה של כמה סמנים על מספר רב של רקמות, אשר יכול להתיש רקמות יקרות. המיקרו-מערך של הרקמה (TMA), שהוצג בשנות ה-80 של המאה ה-20, הוא כלי מחקר חשוב המרכיב אזורי מופת קטנים בעלי עניין מבלוקים רבים ושונים של רקמת FFPE לגוש פרפין יחיד, ומאפשר בדיקה של דגימות רקמה רבות בו זמנית2. לפיכך, TMAs נמנעים משימוש מופרז בדגימות רקמות יקרות מאוד, ולעתים קרובות נדירות, תוך הפחתת העלויות הכרוכות בביצוע יישומים במורד הזרם על דגימות בודדות רבות 3,4.
קיימות מספר טכניקות שונות לבניית TMAs5, כולל גישות אוטומטיות וחצי ידניות 6,7. רוב הגישות האחרונות הללו משתמשות בשיטת המקבל, לפיה ליבות רקמות המנוקבות מבלוקים של תורמים מוכנסות לתבנית טרומית. עם זאת, מומלץ כי בלוקים תורמים “אידיאליים” כי הם לפחות 4 מ”מ עובי משמשים לשיטה זו 6,7. למרבה הצער, בלוקים של תורמים, במיוחד אלה שחולקו באופן נרחב למטרות אבחון קליניות לפני שהם זמינים למחקר, הם לעתים קרובות בעובי של פחות מ-4 מ”מ, מה שעלול להחריג אותם משימוש בבניית TMA בשיטת המקבל, אם הטבעה מחדש כדי להשיג עומק של 4 מ”מ אינה אפשרית או רצויה. יתר על כן, הליכים אלה יכולים לעתים קרובות להשתמש במיקרו-מערך רקמות ידני או במכשירים אוטומטיים יקרים שאינם נגישים או משתלמים למעבדת המחקר הממוצעת. לעומת זאת, שיטת סרט הדבקה הדו-צדדי או שיטת הטייפ, היא שיטת בניית TMA ידנית התואמת לבלוקים לא אידיאליים של תורמים המשתמשת במיקרו-מערכים ידניים זולים, זמינים באופן נרחב, רב-פעמיים או חד פעמיים מסוג 8,9,10. שיטה זו הופכת את תהליך הבנייה על ידי יציקת הבלוק סביב ליבות זקופות הפוכות שעם השלמתן משופעות בחלק העליון של ה-TMA, ללא קשר לאורך הליבה. כתוצאה מכך, כל הדגימות נמצאות בקטעי TMA כאשר הן מחולקות לראשונה, מה שמאפשר לבנאי להפיק את המרב מהגושים הלא אידיאליים האלה מההתחלה. לפיכך, שיטת הקלטת מייצגת חלופה חסכונית וישימה למעבדות המחקר שאינן מיוחדות.
בניית TMA אינה נטולת אתגרים, ויש לנקוט משנה זהירות בעת בחירת אזורי הרקמה שמהם ניתן לחלץ את הליבות, מה שהופך את הסקירה הפתולוגית לחלק קריטי בתהליך הבנייה של TMA11,12. לפיכך, פרוטוקול זה נועד להדגיש את החשיבות העמוקה של סקירה פתולוגית בבניית TMA על ידי הדגשת כמה מהמלכודות הפתולוגיות הקשורות לבניית TMA שאנשים הבונים ומשתמשים ב- TMAs צריכים להיות מודעים אליהם, ומדוע סקירת הפתולוגיה צריכה להימשך לאורך חייו של בלוק TMA.
פרוטוקול זה מתאר את הצעדים שננקטו במעבדת הליבה הטכנית של משאב דגימת האיידס והסרטן (ACSR) כדי לבנות TMAs מבלוקים תורמים שאינם אידיאליים באמצעות שיטת הקלטת; כאשר ה- ACSR הוא ביו-רפוזיטוריה במימון NIH המוקדשת לאיסוף והפצה שוויונית של ביו-פסימנים מרקמות סרטן HIV על מנת לקדם מחקר ממאירות HIV.
אחד המרכיבים הקריטיים ביותר בתהליך הבנייה של TMA הוא סקירת פתולוגיה של בלוקים של תורמי FFPE שמהם יקבלו ליבות ה- TMA4. במהלך הסקירה, פתולוג מוסמך בוחן חתך רקמות מוכתם H&E מייצג מכל גוש תורם. זה הכרחי כי H&E נוצר באמצעות קטע רקמה חתוך טרי, כך שהוא הייצוג הטוב ביותר של בלוק התורם המקביל שלה. השימוש ב-H&Es ישנים יותר אינו מומלץ בהתחשב בכך שרקמות FFPE הן מבנים תלת-ממדיים שפרופיל הרקמה שלהם יכול להשתנות באופן משמעותי עם עומק הבלוק וחתך נרחב; ייתכן שזה קרה מאז שנוצר ה-H&E, מה שעלול להפוך את הייצוג שלו של בלוק ה-FFPE ללא מדויק. תהליך הבדיקה חיוני לבחירת מקרים מתאימים ולזיהוי אזורי רקמות שמהם יש להשיג ליבות, כמו גם לזיהוי אזורים שיש להימנע מהם בעת איסוף ליבות. בהיעדר סקירה פתולוגית, ההסתברות לכלול רקמות לא מתאימות עולה באופן משמעותי. להכללה של רקמות כאלה יש פוטנציאל להפוך את ה-TMA המובנה ללא יעיל ולא מתאים למטרתו המיועדת. חשוב לציין, לשימוש לא מודע ב-TMAs לא יעילים כאלה יש פוטנציאל עצום לגרום לנתונים כוזבים ומטעים. זה בשילוב עם הידיעה שהפרופיל של רקמות FFPE, ולכן הליבות הנגזרות שלהן, יכולים להשתנות באופן משמעותי עם הגדלת העומק מדגיש את החשיבות של המשך סקירת הפתולוגיה לאורך כל חייו של בלוק TMA בנוי. באופן אידיאלי יש ליצור H&Es באמצעות כלמקטע 15 או 20כדי להבטיח שכל שינוי בפרופילי הרקמה של הליבות נלכדים ומתועדים. לכל הפחות, יש ליצור H&Es ולהיבדק בתחילתו ובסיומו של פרויקט כדי לעקוב אחר שינויים פוטנציאליים אלה. לאור נקודות אלה וחשיבותו של ה- TMA ככלי מחקר, חובה על הסקירה הפתולוגית להיות מוטמעת היטב בתהליך בניית ה- TMA ולאורך כל חייו של בלוק ה- TMA.
בלוקי FFPE מחולקים לעתים קרובות באופן נרחב במהלך עיבוד אבחון שגרתי לפני שהם משוחררים למטרות מחקר. כתוצאה מכך, עומק בלוק התורם ולכן אורכי הליבה של בלוק התורם הם לעתים קרובות פחותים מהאידיאל של שיטת המקבל של 4 מ”מ. כאן הדגמנו כיצד לבנות TMAs באמצעות פרוטוקול בניית שיטת הקלטת, שהיתרון העיקרי שלו הוא תאימותו לליבות מבלוקים לא אידיאליים של רקמת FFPE. למרות ששיטת הקלטת היא בעלת ערך מחקרי רב ומציעה שיטה זולה, נוחה ונגישה לבניית בלוקי TMA, היא אינה נטולת אתגרים ומגבלות. בהשוואה לשיטות נמענים אוטומטיות וידניות, שיכולות להכיל 100-1,000 ליבות בבלוק TMA יחיד, מומלץ לכל היותר 40 ליבות עבור TMAs שנבנו בשיטת הקלטת9. מגבלה נוספת היא ביחס לקלות הבנייה. בשיטת הנמען, ליבות מנוקבות מוכנסות רק לתבנית precast, המספקת יציבות ליבה על ידי עטיפת כל ליבה בבאר האינדיבידואלית שלה, ובכך מונעת נדידת ליבה כמו גם מקדמת מיקום ליבה והפרדה רגילים מאוד22. יתר על כן, שיטת הנמען מציעה את הנוחות האופציונלית של להיות ידני לחלוטין, חצי ידני, ואוטומטי לחלוטין. לעומת זאת, שיטת הטייפ הידנית דורשת מיקום זהיר ועדין של כל ליבה ביד באמצעות בחירת מחט. למרות שהיעדר תבנית precast בשיטת הקלטת מונע את המיקום וההפרדה הרגילים ביותר שחווים בשיטת הנמען, חסר זה מתגבר באמצעות הכללת רשת משובצת. חשוב שהרשת המשובצת תוצמד למרכז מגש המתכת על מנת למנוע מיקום קצה בלוק, מה שמגדיל את הסיכון לאובדן הליבה אם אין מספיק פרפין שמחזיק את הליבה במקומה. כמו כן יש לציין כי הפרדות הליבה הקטנות האפשריות בשיטת הנמען אינן ניתנות להשגה בשיטת הקלטת בשל מיקום הליבה הידני והצורך בבחירת המחט כדי להתאים בין ליבות סמוכות. הליבות ממוקמות בצורה זקופה העומדת בפני עצמה עם שטח הפנים או טביעת הרגל הקטנים ביותר של הליבה היוצרת קשר עם הרשת המכוסה DSST. הגדרה זו מספקת יציבות ליבה נמוכה משמעותית משיטת הנמען ומעניקה סיכון מוגבר להפלת ליבה או הגירה בעת שפיכת הפרפין המותך. ואכן, אחד השלבים הקריטיים ביותר בפרוטוקול הוא מזיגת הפרפין המותך. זה חיוני כי זה נעשה במהירות עם ההסרה מהתנור כדי להבטיח את הפרפין הוא נוזלי לחלוטין וכי המזיגה מבוצעת בעדינות עם מערבולות מינימליות. באופן מעניין, Chen et al. פיתחו מכשיר עזר חדשני ביותר, הדומה לשבלונה עם 7 x 11 חורים בקוטר 2 מ”מ המפוזרים באופן שווה, הממוקמת על גבי בלוק פרפין ריק כדי להנחות מחטים בעת יצירת בלוק המקבל וכאשר מכניסים את ליבות בלוק התורם23. למרות שתוכנן לסייע בבניית בלוקים של מקבלים, מכשיר כזה יכול בקלות להיות מותאם לשיטת הקלטת כדי להנחות את המיקום, לווסת את ההפרדה ולהגביר את יציבות הליבה במהלך תהליך הבנייה.
אחד הגורמים המשפיעים המשמעותיים ביותר על יציבות הליבה הוא מספר הליבות הכלולות בשיטת קלטת TMA. הסיבה לכך היא שככל שמספר הליבות גדל, קוטר הליבה חייב לרדת על מנת להתאים למספר ההולך וגדל של ליבות, מה שבתורו מקטין את טביעת הרגל של הליבה הדבקה בשעון הקיץ. קוטר ליבה מינימלי של 1 מ”מ מומלץ לבניית TMA בשיטת קלטת, שכן מצאנו כי ליבות עם קטרים קטנים יותר אינן יציבות במיוחד ונוטות להפיל אפילו עם מזיגת פרפין עדינה מאוד. מחקר שנערך לאחרונה ובחן שתי שיטות פנימיות שונות שהשתמשו במחטים של 16 גרם (קוטר ליבה של 1.1 מ”מ) ובאגרוף בקוטר 4 מ”מ חוו אובדן רקמות משמעותי עם 1.1 מ”מ (26.5%) אך לא עם ליבות 4 מ”מ24. נראה כי הדבר מצביע על כך שליבות קטנות יכולות להיות בעייתיות לעבוד איתן ולא רק במהלך הבנייה. יתר על כן, קטרים קטנים יותר עשויים שלא לייצג את גוש התורם המקורי כמו גם ליבות גדולות יותר, מה שמקשה על פרשנות פתולוגית ומגדיל את ההסתברות לייצוג לא מדויק של רקמות התורם.
להכללה ולמיקום של בלוקי התמצאות יש חשיבות עמוקה בבניית TMA. עם זאת, יש לכך חשיבות מיוחדת עבור TMAs שנבנו בשיטת קלטת. זה נובע מהעובדה ששיטת הקלטת הופכת את תהליך הבנייה ובכך מגדילה את הסיכון לדיסאוריינטציה מרחבית. אנו ממליצים לכלול עד שלוש ליבות כיוון בכל בלוק, וכי הן ממוקמות הרחק מליבות הדגימה על מנת לכוון את הבלוק בצורה הטובה ביותר. ליבות אוריינטציה יכולות להיות ליבות שנלקחו מגושי רקמות המכילים רקמות שונות באופן מובהק מהנושא של TMA הבנוי או כלי אוריינטציה ללא רקמות21, כאשר האחרון מועיל במיוחד למי שאינם פתולוגים. בשילוב עם מיקום ליבה לא רגיל בתבנית מטריצה, ליבות אוריינטציה ממזערות את הסיכון לדיסאוריינטציה.
ההבדל הבולט באורך הליבה בין TMAs שנבנו בשיטות הקלטת והמקבל נובע מהכללת עומק בלוק התורם בתהליך קבלת ההחלטות בעת בחירת שיטת הבנייה. הפרוטוקול המתואר כאן משתמש בסף שבו TMAs נבנים בשיטות הקלטת והמקבל כאשר לבלוקי התורם יש עומקים של <4 מ"מ ו-4 מ"מ, בהתאמה. חשוב לציין כי הכללת עומק בלוק התורם בבחירת שיטת הבנייה אינה אוניברסלית. למרות שניתן לבנות TMAs בשתי השיטות ללא קשר לעומק בלוק התורם, ליבות גבוהות יותר יכולות להפריע, או להפיל או להטות על ידי, את המיקום של קלטת הפלסטיק במהלך בניית TMA באמצעות שיטת הקלטת. הבחירה לכלול או להשמיט קריטריונים בתהליך קבלת ההחלטות תלויה בנוחיות הזמינה למעבדה, בעלות ובתוצר הסופי הרצוי. תחת הפרמטרים של פרוטוקול זה, מספר קטעי ה- TMA המותקנים בשקופיות שניתן לקבל משיטת קלטת שנבנתה TMA נמוך משמעותית מזה המתקבל משיטת נמען שנבנתה על ידי TMA. למרות שניתן לחסום מחדש את רקמות ה- FFPE כדי להגדיל את עומק בלוק התורם ולהפוך אותן לתואמות לשיטת המקבל, ההסתברות להשיג את אותה כיוון רקמה בתוך הבלוק מחדש היא נמוכה. בתורו, זה עשוי לדרוש חסימה נרחבת מול כדי לקבל קטע פנים מלא, אשר ככל הנראה יכלול אובדן רקמות משמעותי. לאחר הפנייה לחסימה, שיטת קלטת שנבנתה TMA מניבה כ-50 קטעי TMA המותקנים על שקופיות כאשר כל הליבות קיימות. עם זאת, המספר המדויק ישתנה מגוש לבלוק ותלוי באורך הליבות המשמשות לבניית ה-TMA ובעובי החלקים שנחתכו (5 מיקרומטר לעומת 4 מיקרומטר). יתר על כן, יש לציין גם כי בגלל אורכי הליבה השונים שלהם, הליבות יתישו בזמנים שונים ככל שה- TMA מחולק בהדרגה; תכונה המדגישה מחדש את הצורך בהמשך סקירה פתולוגית.
למרות ששיטת הנמען מציעה יתרונות ויתרונות משמעותיים על פני שיטת הקלטת, כולל תהליכי בנייה פחות מייגעים ומהירים יותר, שיטת הקלטת אינה מכוונת למעבדות מנוסות בתפוקה גבוהה. הוא מכוון למעבדה הממוצעת, במיוחד אלה שנמצאים במסגרות מוגבלות במשאבים, עם גישה לבלוקים תורמים בעומקים משתנים אך לא לשירותי בנייה של TMA. עם זאת, יישומים עתידיים עשויים לראות אוטומציה של שיטה זו על מנת לשפר את מאגר הדגימות הזכאיות במעבדות בעלות תפוקה גבוהה ולבטל את הצורך בחסימה מחדש של בלוקים של תורמים. לסיכום, ניתן להקים בקלות את פרוטוקול בניית שיטת הקלטת TMA המתואר במעבדות שאינן מתמחות ללא צורך בציוד יקר. עם זאת, מומלץ כי משתמשים חדשים צריכים להשתמש בלוקים רקמת FFPE ללא ערך, כלי אוריינטציה צבעונית ללא רקמות21 או אפילו בלוקים פרפין צבעוניים ללא רקמה בהתחלה על מנת להכיר את טכניקת שיטת הקלטת לפני התקדמות לבניית TMA באמצעות רקמות יקרות. למרות שבנייתם אינה נטולת מלכודות פוטנציאליות, שגם אלה שבונים וגם משתמשים בבלוקים של TMA צריכים להיות מודעים אליהם, שיטת הבנייה “תוצרת בית” הלא מלוטשת לכאורה הזו של TMA יכולה להניב TMAs איכותיים ורלוונטיים ביולוגית למחקר. ואכן, מקטעי TMA הנובעים משיטת קלטת שנבנתה TMAs הם בין דגימות הרקמה המבוקשות ביותר בביו-רפוזיטוריה של ACSR.
The authors have nothing to disclose.
המימון לעבודה זו סופק על ידי משאב דגימת האיידס והסרטן (ACSR) הממומן על ידי NIH (www.acsr1.com), UM1CA181255.
BX51 microscope | Olympus | BX51 | |
cellSens imaging software | Olympus | x | |
Cotton Balls | FisherBrand | 22-456-880 | |
Double sided tape (removable) | Scotch | 383534 | |
DP72 camera | Olympus | DP72 | |
Economy Lab Oven | FisherBrand | 13246516GAQ | |
Forceps | Various | x | |
Formula "R" (paraffin) | Leica | 3801450 | |
Glass microscope slides | FisherBrand | 12-550-15 | |
Low Profile Micotome Blades | Accu-Edge | 4689 | |
Microtome | Leica | RM2265 | |
Permanent marker | Electron Microscope Sciences | 72109-12 | |
Quick Ray manual tissue microarrayer set | Unitma | UT06 | |
Stainless-Steel Base Molds | FisherBrand | 22-038-209 | |
Tissue Cassette Cooling Tray | Electron Microscope Sciences | 63314 | |
Tissue Processing/Embedding Cassette | FisherBrand | 15-182-701E | |
Waterbath | Triangle Biomedical Sciences | TFB-120 | |
Wooden stick | FisherBrand | 22363158 |