2.4: 可视化的土壤微生物，通过接触滑动检测和显微镜

1.土壤幻灯片缩影制备

1. 从表面收集园土 (0-6"深度)，和成两个单独杯重量 150 克土。
   1. 如果土壤有机物质密度高，重量 100 克。
2. 标签一杯"待遇"和其他"控制"。
3. 计算所需改变水分含量的水量。
   1. 水分含量经常是接近田间持水量。
      
4. 蒸馏水用量筒测量量。
5. 倒入两小瓶的蒸馏水量。
6. 标签一小瓶"待遇"和其他"控制"。
7. 在"待遇"土壤干燥重量依据修订足够葡萄糖为最后一层泥土葡萄糖浓度为 1%，与"治疗"瓶中的水。
8. 200 毫克 NH₄₃没有加入"治疗"瓶，搅拌溶解的修订。硝酸盐作为氮源营养物质在土壤中的微生物。
9. 不修订"控制"小瓶。
10. 在小整除的大约 50 毫克，拌匀成"待遇"杯"待遇"小瓶的内容。用锅铲搅拌后每个分装的加法。
11. 在小整除的拌匀成"控制"杯"控制"小瓶的内容。用锅铲搅拌后每个分装的加法。
12. 四个干净的显微镜载玻片的标签: 两个"待遇"和"控制"的两张幻灯片。
13. 两个"待遇"幻灯片插入"待遇"土杯，并将两个"控制"幻灯片插入到"控制"土杯。离开 2 厘米的每张幻灯片上的土壤表面的突起，一定要两个幻灯片之间留下的缺口。
14. 盖杯用塑料包装并确保它用一根橡皮筋。
15. 几次穿刺包允许空气，但仍然阻止过度蒸发。
16. 记录两个杯子的重量。
17. 填土的杯子，在室温下，在一个指定区域孵化器孵育 7 天。

2.幻灯片染色及显微镜

1. 记录两个杯子的重量。
2. 幻灯片删除时计算土壤水分。
3. 按每张幻灯片到倾斜的位置并撤回所以不干扰幻灯片的上部的脸从每个杯子删除两张幻灯片。
4. 识别和标识的一侧要染色，观察到的幻灯片。
5. 轻轻地敲上台阶顶要删除大型土壤颗粒的幻灯片。
6. 使用湿纸巾，洁面低的幻灯片。干燥的室温的幻灯片。
7. 戴护目镜及与钳持每张幻灯片，浸泡成 40%(v/v) 乙酸为 1-3 分钟下风柜幻灯片。
8. 冲洗掉过剩的酸下一连串温柔的水。
9. 使用滴管瓶，覆盖表面的酚醛孟加拉幻灯片。在容器赶上多余染色染色架上支持幻灯片。要小心，不要洗与可能删除幻灯片的表面微生物的力量。
10. 染色的幻灯片 5-10 分钟，不要让幻灯片变得干燥。添加所需的更多污点。
11. 轻轻地清洗幻灯片删除多余的污点。
12. 让室温干燥的幻灯片。
13. 使用油浸物镜，观察幻灯片使用显微镜 (图 1)。

图 1。在显微镜下一张幻灯片。

土壤中各种生物体与无机成分之间的关系对于理解土壤变化和环境胁迫至关重要，但如果没有直接可视化，就无法阐明。

土壤是一个极其复杂的系统，是数百万不同生物的栖息地。特别是直接围绕植物根部的土壤区域，称为根际，包含一系列独特的生物，这些生物体直接受到植物根部的影响。

根际的非生物或非生物成分包括大小和形状不同的无机颗粒，这些颗粒有助于土壤的质地。生物或生物部分包括植物残留物、根、有机物和微生物。

本视频将演示根际土壤的生物和非生物成分的直接可视化，以了解影响土壤变化的因素并预测环境胁迫。

微生物往往居住在位于土壤孔隙内的水中。细菌是土壤中存在的最简单、最丰富的生物之一，以多种形态存在，包括称为球菌的球体、称为杆菌的杆状和丝状形式。

真菌种类，如酵母和霉菌，是土壤中第二丰富的生物。它们的作用是分解和回收死亡的有机物。微观丝状真菌在视觉上与其他微生物不同，因为它们具有释放孢子的长而分枝的菌丝。

直接观察这些生物体之间的关系具有挑战性，但可以使用接触玻片测定来实现。这种方法是将载玻片浸入土壤中数天，然后让生物体和土壤颗粒吸附到载玻片表面。

然后以一定角度去除载玻片，以防止表面弄脏。微生物用乙酸固定，并用 Rose Bengal 染色剂染色，以便通过光学显微镜进行可视化。

现在您已经了解了接触式载玻片测定技术背后的原理，让我们来看看实验室中的过程。

首先，收集地表花园土壤并将土壤转移到实验室中。称取 150 克土壤放入 2 个单独的容器中。应将一个容器标记为处理样品，该样品将用营养物质进行改性，以促进生物体的快速增殖。将另一个标记为控件，该控件将保持不变。

使用本集合的测定土壤中水分含量视频中展示的技术计算土壤中的含水量。根据此计算，根据干重确定土壤中的水量。现在计算需要添加的水量才能得到 15% 的土壤水分含量。这使水分达到田间容量，最适合微生物生长。

使用量筒测量计算的蒸馏水量。将计算出的水体积倒入每个容器中。根据先前确定的土壤干重，使用干重基础计算达到 1% 质量的最终土壤葡萄糖浓度所需的葡萄糖量。称取此量的葡萄糖，仅将其添加到治疗容器中。

称取 200 mg 硝酸铵，然后仅将其添加到处理容器中。硝酸铵是土壤微生物的含氮养分来源。在容器中混合土壤、葡萄糖和硝酸铵混合物。

接下来，标记 4 张干净的显微镜载玻片：两张作为处理，两张作为对照。将两张处理玻片插入处理土壤容器中。让每个幻灯片的一部分暴露在土壤表面上方，并确保两个幻灯片之间有间隙。

以相同的方式将两个对照玻片插入对照土壤容器中。用保鲜膜盖住杯子，并用橡皮筋固定。刺穿保鲜膜数次以允许空气流通，但仍能防止过度蒸发。

最后，称量两个杯子，记录它们的重量，并在室温下在指定区域孵育 7 天。

孵育 7 天后，通过称量土杯来计算土壤水分含量。确定体重是否因水分蒸发而减轻，并在需要时更换水。

从容器中取出保鲜膜，将每张载玻片压到倾斜位置，然后从土壤中取出两张载玻片，然后撤回，以便载玻片的上表面不受干扰。

轻轻敲击载玻片以去除大的土壤颗粒。使用湿纸巾清洁载玻片的下表面。让它们在通风橱中在室温下干燥。干燥后，用镊子拿起载玻片，将其浸入乙酸中 1 到 3 分钟。

用温和的蒸馏水冲洗载玻片的顶部以去除多余的酸。对所有幻灯片重复这些步骤。让载玻片风干。

将载玻片放在容器上方的染色架上，以捕获多余的染料。使用滴管，用酚醛 Rose Bengal 染料轻轻覆盖每个载玻片的表面。让载玻片染色 5 到 10 分钟，根据需要注意添加更多染料以保持载玻片湿润。用水轻轻冲洗玻片以去除多余的污渍，并让玻片在室温下干燥。

使用油浸物镜在光学显微镜上检查载玻片。处理过的土壤会有更多的土壤微生物。

典型土壤样品中真菌和细菌生物之间的空间相互作用可以很容易地可视化。土壤颗粒显示深色不规则形状。

真菌生物显示厚的丝状菌丝，而放线菌显示薄的丝状菌丝。

细菌以小球菌或棒状形式存在，通常成团，位于土壤颗粒或真菌菌丝衬里上。

生物体从土壤中直接分离对于理解土壤和环境特性非常重要。

昆虫病原线虫是寄生在昆虫身上的微小蛔虫。虽然它们在接触玻片测定中不可见，但它们可以从收集的土壤样品中分离出来，如本例所示。

首先，使用通过目视检查识别的昆虫在土壤中诱饵线虫。通过将死昆虫放在潮湿黑暗的环境中，让线虫迁移到周围的水中，将线虫与死昆虫诱饵分离出来。然后从水中收集线虫并进行分析。

丝状真菌由于在养分循环中的作用而对土壤健康至关重要。在这个例子中，从土壤中分离和观察了丝状真菌。

用水稀释土壤样品，并加入分离的无菌孟加拉玫瑰链霉素琼脂平板中。链霉素阻止细菌生长，并促进真菌生长。对真菌菌落进行计数，并使用胶带将其固定在载玻片上。然后使用光学显微镜对真菌进行成像。

土壤微生物会自然分解土壤中的成分，例如死亡的植物和生物。检查了可生物降解塑料薄膜的生物降解和定植，如本例所示。

从埋在土壤中数月的塑料薄膜中分离出真菌。然后单独测试真菌在塑料薄膜上的生长情况。然后将塑料薄膜与选定的真菌菌株一起孵育，没有生长介质，以观察真菌对塑料的直接降解。

您刚刚观看了 JoVE 对用于土壤微生物定性成像的接触玻片测定的介绍。您现在应该了解如何准备接触载玻片，并可视化土壤微生物。感谢观看！