通过接触玻片法与显微镜技术可视化土壤微生物

1. 土壤滑片微宇宙的制备

1. 采集表层（0–6英寸深度）的园土，将150 g土壤分别称量至两个独立的杯子中。
   1. 若土壤有机质含量较高，则称取100 g。
2. 将其中一个杯子标记为“处理组”，另一个标记为“对照组”。
3. 计算调节土壤含水量所需的水量。
   1. 土壤含水量通常接近田间持水量。
      
4. 使用量筒量取所需体积的蒸馏水。
5. 将量取的蒸馏水分别倒入两个小瓶中。
6. 将其中一个小瓶标记为“处理组”，另一个标记为“对照组”。
7. 向“处理组”小瓶中的水中加入足量葡萄糖，使“处理组”土壤中葡萄糖的终浓度达到1%（以干重为基础计算）。
8. 向“处理组”小瓶中加入200 mg NH₄NO₃，搅拌至添加剂完全溶解。硝酸盐作为土壤微生物所需的氮素营养来源。
9. 不要对“对照组”小瓶进行任何添加处理。
10. 以每次约50 mg的小份量，将“处理组”小瓶中的溶液逐步混入“处理组”杯中的土壤。每次加入后均用刮刀充分搅拌。
11. 以小份量将“对照组”小瓶中的溶液逐步混入“对照组”杯中的土壤。每次加入后均用刮刀充分搅拌。
12. 标记四张洁净的显微镜载玻片：两张为“处理组”，两张为“对照组”。
13. 将两张“处理组”载玻片插入“处理组”土壤杯中，两张“对照组”载玻片插入“对照组”土壤杯中。每张载玻片需有2 cm部分露出土壤表面，并确保两片载玻片之间留有间隙。
14. 用塑料薄膜覆盖杯口，并用橡皮筋固定密封。
15. 在塑料膜上穿刺数个小孔，以允许气体交换，同时防止过度蒸发。
16. 记录两个杯子的总重量。
17. 将装有土壤的杯子置于室温下指定区域或培养箱中，避光培养7天。

2. 载玻片染色与显微镜观察

1. 记录两个杯子的重量。
2. 计算移除载玻片时的土壤含水量。
3. 通过将每个载玻片压至倾斜位置并抽出的方式，从每个杯子中取出两张载玻片，确保载玻片的上表面不受扰动。
4. 确定并标记需要染色和观察的载玻片侧面。
5. 轻轻将载玻片在实验台面上敲击，以去除较大的土壤颗粒。
6. 使用湿润的纸巾清洁载玻片的下表面，并在室温下晾干。
7. 佩戴防护眼镜并用镊子夹持每张载玻片，在通风橱中将其浸入40%（v/v）乙酸溶液中1-3分钟。
8. 用缓流的水冲洗掉多余的酸液。
9. 使用滴瓶将酚性玫瑰红染液覆盖于载玻片表面，将载玻片置于染色架上，下方放置容器以承接多余染液。注意操作轻柔，避免用力冲洗导致载玻片表面的微生物被冲走。
10. 染色5-10分钟。切勿让载玻片变干，必要时可补充染液。
11. 轻轻冲洗载玻片以去除多余染液。
12. 将载玻片在室温下自然干燥。
13. 使用油镜，在显微镜下观察载玻片（图1）。

图 1. 显微镜下的载玻片。