环境来源细菌的革兰氏染色

1. 样品采集

1. 采集土壤样品并运送至实验室进行微生物分析。
2. 在实验室中，使用分析天平称取10 g样品。
3. 将样品按1:10比例稀释至95 mL磷酸盐缓冲液中（10份土壤相当于5份水相液体），并涡旋混匀（图2，步骤1）。
4. 继续进行1:10系列稀释，直至每毫升含至少10^-5 g土壤，并将选定的稀释液取两到三个重复接种于低营养琼脂培养基（例如，R2A）进行涂布平板（图2，步骤2-3）。
5. 将平板在室温下培养一周（图2，步骤4）。
6. 挑选一至两个菌落进行分离，并划线接种至新的琼脂平板上（图3，步骤1-3）。
7. 将划线平板在室温下培养两至三天（图3，步骤4）。

2. 细菌涂片的制备

1. 观察划线平板上的单个菌落。
2. 制备每张涂片时，将接种环浸入乙醇中，火焰灭菌后，取1至2环无菌蒸馏水置于预先清洁的玻璃载玻片中央。
3. 再次按前述方法灭菌接种环。待其冷却后，从单个孤立菌落中挑取少量培养物，并与载玻片上的水滴混合（涂片应呈现类似稀释脱脂奶的外观）。接种环在接触菌落前必须充分冷却；若接种环过热，会导致菌落和/或培养基飞溅，可能引起细菌气溶胶化。通常，当接种环过热时，接触琼脂或菌落会发出“嘶嘶”声。接种环冷却不足还可能导致菌体转移效率降低以及细胞形态失真。
4. 将涂片在载玻片表面均匀涂抹，范围约为2.5 cm × 2.5 cm，随后静置使其自然风干。风干过程应在层流条件下进行。切勿用气流吹干，以免破坏涂片结构。同时，严禁火焰干燥，以保持细胞原有形态。
5. 干燥后，将载玻片快速通过火焰2至3次进行热固定。切勿将载玻片静止停留在火焰中，以防细胞形态扭曲或玻璃载片受损。

3. 革兰氏染色

1. 使用干净的衣夹将玻片一端固定。
2. 用结晶紫（初染剂）覆盖涂片，染色 2 至 3 分钟。
3. 用蒸馏水小心冲洗玻片，冲洗时水流不应直接对准涂片，以防止涂片受损或从玻片上脱落。
4. 用革兰碘液覆盖涂片，作用 2 分钟，然后用清水轻轻冲洗。
5. 用 95% 乙醇脱色，直至不再有染料被洗脱（通常不超过 20 秒，具体时间取决于涂片厚度），然后立即用蒸馏水冲洗。此步骤至关重要，以避免过度脱色，否则可能导致革兰染色结果误判（i.e., 革兰可变）。
6. 向涂片滴加复染剂（沙黄），染色 30 秒，然后用蒸馏水轻轻冲洗，并用吸水纸吸干。

4. 载玻片的显微镜观察

1. 使用低倍（例如，4X 或 10X）、高倍干镜（例如，40X）和油浸物镜（100X）观察玻片。使用油浸物镜时，直接将镜油滴加至涂片上。
2. 有关革兰氏阳性与革兰氏阴性土壤细菌的代表性结果，请参见图 4和图 5。

图2. 稀释与涂布平板技术。 请点击此处查看此图的放大版本。

图3. 使用划线平板法进行菌落分离。

图 4. 革兰氏阳性土壤细菌 Staphylococcus aureus。

图 5. 革兰氏阴性土壤细菌 Escherichia coli。