细菌生长曲线分析及其环境应用

测量细菌的生长速率是一种基础的微生物学技术，在基础研究以及农业和工业应用中具有广泛用途。

细菌是地球上最丰富的生命形式之一，存在于包括人体在内的每一个生态系统中。某些细菌种类在遗传上具有高度可操作性，已被用作研究模型，或用于在工业规模上生产天然或合成产物。然而，并非所有细菌种类都能在实验室中培养。对于那些能够培养的细菌，一个重要的特征是其增殖速率，即“生长动力学”。

测量细菌培养物的生长速率可为科学家提供有关其生理和代谢功能的信息，同时也有助于在后续应用中获得准确的细菌细胞数量。

本视频将介绍细菌生长速率分析的基本原理，演示利用“生长曲线”表征生长速率的实验方案，并最后探讨测量细菌生长动力学在环境科学中的若干应用。

细菌通常通过无性繁殖进行增殖，即通过简单的二分裂方式，一个母细胞分裂为两个完全相同的子细胞。在营养物质丰富且温度等环境条件适宜生长的有利条件下，其增殖速率远超过死亡速率，从而导致指数级增长。

通过测量培养物中细菌数量随时间的变化，可以获得一条生长曲线。在液体培养基中以最佳条件培养细菌时，会得到具有典型形状的生长曲线，该曲线可分为若干阶段。曲线起始于“迟缓期”，此时细菌正在适应培养条件，生长缓慢。随后进入“对数期”或“指数生长期”，细菌在此阶段呈指数增长。随着营养物质耗尽和代谢废物积累，细菌生长逐渐停滞，进入“稳定期”。最后，当细胞死亡速率超过增殖速率时，培养物进入“衰亡期”。

为了构建生长曲线，需在一定培养期间内的不同时间点，对液体培养物烧瓶中的细菌数量进行计数。细菌计数可通过多种不同方法获得。一种常用方法是测量光密度（OD600），即细菌溶液在600 nm波长下的光吸收值。

另一种方法是测定培养物每毫升中的“菌落形成单位”（CFU）。由于细菌生长具有克隆性，理论上培养物中的一个细菌可在琼脂平板上扩增为一个可观察到的菌落。通过将细菌培养物进行一系列稀释，采用称为“连续稀释涂布法”的方法，使稀释后的细菌浓度达到能够观察到单个、分离菌落的程度，随后可根据菌落数量反推出每毫升培养物中的细菌浓度（以CFU/mL表示）。

现在您已经了解了如何分析细菌生长，接下来我们将介绍一种实验方案，即利用连续稀释涂布法对一种已确立的细菌模型——大肠杆菌（Escherichia coli）的纯培养物进行生长曲线分析。

在采集时间点前 1 天，向 50 mL 锥形瓶中的 20 mL 预先灭菌的胰蛋白胨大豆肉汤（TSB）培养基中接种一株大肠杆菌单菌落。

37 °C 摇床培养过夜。对于大肠杆菌，此时菌液进入稳定期，菌浓度约为 109 CFU/mL。

次日，取100 µL过夜培养物接种至500 mL锥形瓶中的250 mL TSB培养基中，充分混匀。此稀释培养物的浓度约为4 × 10⁵ CFU/mL。将5 mL该稀释培养物分装至一支培养管中，此为时间点0（即T₀）的等分试样，立即于4 °C冰箱中冷藏保存。

将剩余培养液体积在37 °C下振荡孵育。此后每小时直至8 h，从培养液中收集5 mL等份样品。将这些样品分别标记为T1至T8，并全部在4 °C下保存至使用。

实验当天，从冰箱中取出大肠杆菌（E. coli）各时间点的等份样品，并置于冰上保存。使用无菌微量离心管，每管加入900 µL无菌生理盐水，根据下表为每个样品等份建立稀释系列。

轻轻涡旋混匀 T0 培养物，然后取 100 µL 加入其稀释系列的 A 管中，制成 1 比 10（即 10⁻¹）的稀释液。涡旋 A 管以充分混匀，使用新的移液器吸头，取 100 µL A 管溶液加入 B 管中，制成 1 比 100（即 10⁻²）的稀释液。

对每个培养样品重复此步骤，并根据表2进行相应的系列稀释。完成所有时间点样品的系列稀释后，准备适当数量的无菌胰蛋白酶大豆琼脂平板，用于细菌涂布。

每个时间点的培养物将按以下表格进行3个稀释度的涂布，每种处理设3个重复。请相应标记培养皿。然后，用移液器吸取100 µL适当稀释的培养物，加至相应琼脂平板的中心。将“L”形玻璃涂布棒在火焰上灭菌，冷却时将涂布棒轻触接种物以外区域的琼脂表面，随后立即均匀涂布液体。请注意，若涂布操作延迟，可能导致接种点处细菌过度生长。

对所有9个时间点的培养物继续进行各稀释系列的涂布，每完成一个稀释系列后，用火焰灭菌玻璃涂布棒。

待平板静置干燥数分钟后，倒置并放入37 °C培养箱中过夜培养。经过此阶段的生长后，可将平板储存于4 °C环境中。

稀释平板过夜培养后，检查是否存在污染以及菌落分布的均匀性。针对每个时间点的培养物，选择每个平板上有 30-300 个菌落的稀释度，对该稀释度的三个重复平板上的菌落数量进行计数。

根据每次稀释的平均菌落数和稀释倍数，计算每个时间点原始培养物中的细菌浓度，单位为 CFU/mL。例如，若从 0.1 mL 的 10-4（即 1 比 10,000）稀释液中获得的三份重复平板平均有 30 个菌落，则细菌浓度为 30 除以 0.1 mL 再乘以 10,000，即 300 万 CFU/mL。

根据每个时间点计算出的细菌浓度，绘制细菌浓度（CFU/mL）的常用对数（以10为底的对数）随时间（小时）变化的曲线图。从图中确定原始细菌培养物的对数生长期，并选择对数期内的两个时间点，将其中较早的时间点记为 t = 0。使用公式 X = 2^n × X₀ 计算平均代时，其中 X 为时间 t 时的细菌浓度，X₀ 为 t = 0 时的初始浓度，n 为两个时间点之间经历的世代数。

例如，假设初始浓度 X0 为 1,000 CFU/mL，在 t = 6 h 时，浓度为 16,000 CFU/mL。根据该公式计算，6 小时内共发生了 4 代，因此每代时间为 6 除以 4，即每代 1.5 小时。

细菌生长动力学的测定对于科研、农业或生物工程领域的诸多应用至关重要。

了解细菌生长速率的一个用途是能够准确获取一定量的细菌培养物，用于接种另一种培养物或培养基。例如，某些作物（如豆科植物）需要与一种称为根瘤菌的共生细菌共同生长，这些细菌定殖于植物根部形成根瘤，并“固定”氮素——将大气中的氮转化为植物可利用的氨。在农业应用中，将已知数量的根瘤菌加入基于泥炭的碳源培养基中，然后用其接种豆科植物种子，以建立植物与细菌之间的共生关系。

生长分析还可用于鉴定能够降解工业废物并可能产生有价值副产物的细菌种类。在此示例中，研究人员探究了添加了黑液（造纸制浆和纸张生产过程中产生的废弃物）的培养基对一种环境微生物分离株生长的影响。

这些细菌不仅在黑液中表现出增强的生长能力，还呈现出“双相”生长模式，表明黑液中存在多种细菌可代谢的碳源。随后可提取黑液中的各个组分，以进行更详细的生长分析。

最后，生长速率的测定也有助于表征那些为特定工业用途而改造的细菌，例如用于石油污染的修复。在此类研究中，科学家构建了含有可降解油类烃组分酶的基因工程菌株。通过生长分析，例如验证在有毒烃类存在条件下，工程菌的生长速率是否高于普通细菌，从而表明其耐受性得到改善，能够更有效地发挥清除污染物的功能。

您刚刚观看了 JoVE 关于使用生长曲线分析细菌生长速率的视频。现在，您应该了解细菌培养物的不同生长阶段，掌握通过时间点取样和连续稀释涂布法获取生长曲线的实验操作方法，以及生长分析在科研和工业领域中的应用。一如既往，感谢观看！