细菌生长曲线分析及其环境应用

1. 细菌培养物分装样品的收集

1. 在采集生长时点样本的前一天，将大肠杆菌（E. coli）接种于50 mL锥形瓶中的20 mL胰蛋白胨大豆肉汤（TSB）培养基中。
2. 在27 °C条件下过夜培养。这一相对较长的培养周期可使野生型大肠杆菌（E. coli）达到约10⁹ CFU/mL的稳定期菌群密度。
3. 次日，取100 µL已制备的菌液接种至500 mL锥形瓶中的250 mL TSB培养基中，充分混匀。立即取出5 mL等分试样并置于4 °C冰箱中冷藏。此为T = 0或T₀时点样本，菌液浓度应约为4 × 10⁵ CFU/mL。
4. 将剩余的E. coli菌液（245 mL）置于37 °C摇床培养箱中培养。每隔1小时取5 mL培养液样本，持续取样至8小时。每份样本取出后立即于4 °C保存。将这些样本依次标记为T₁至T₈。

2. 连续稀释

1. 移除等分试样 E. coli 从冰箱中取出并置于冰上运输。所有培养物在使用前均需保持在冰上。
2. 设置一系列稀释管，以获得每种样品的不同稀释度 E. coli 培养图3。微量离心管适用于此用途。每根稀释管中应加入900 µL稀释液（无菌生理盐水）。每种样本均需制备一系列稀释梯度 E. coli 培养（T₀ 通过 T₈）；根据以下信息标记每支试管 表2.
   
   图3. 涂布平板操作流程示意图 E. coli.
3. 开始稀释时，加入 100 µL E. coli 从标记为 T 的试管中₀ （初始） E. coli 培养物）加入试管 A，即 10^-1 T 的稀释₀将试管涡旋振荡5秒。
4. 随后，取100 µL的A管溶液加入下一支含有生理盐水的试管（B管），即10倍稀释管^-2 T 的稀释₀继续对每个时间点的等分试样进行所需的稀释系列。转移前务必涡旋振荡每支试管，并且每次转移均需使用新的移液器吸头。

E. coli 培养物	所需稀释度及试管编号
	A	B	C	D	E	F	G
T0	10-1	10-2
T1	10-1	10-2
T2	10-1	10-2	10-3
T3	10-1	10-2	10-3	10-4
T4	10-1	10-2	10-3	10-4	10-5
T5	10-1	10-2	10-3	10-4	10-5	10-6
T6	10-1	10-2	10-3	10-4	10-5	10-6	10-7
T7	10-1	10-2	10-3	10-4	10-5	10-6
T8	10-1	10-2	10-3	10-4	10-5	10-6

表2. 每种大肠杆菌（E. coli）培养物所需的稀释系列。

3. 涂布

1. 每种三个稀释度 E. coli 培养时间点的等分试样将被接种，依据 表3. 用时间点（T）标记培养皿₁ 通过 T₈），稀释倍数以及需添加的体积。每个稀释度使用三个复孔。
2. 将每种稀释液各取 100 µL，用移液器加至琼脂平板的中心位置（图3）。立即使用火焰灭菌的“L”形玻璃涂布棒将等份试样涂布均匀。若未立即涂布，该试样会吸附 原位 在平板上导致初始接种位置出现细菌过度生长。
3. 对每个稀释系列的各时间点 T 重复进行平板接种₁ 通过 T₈记得在不同培养皿之间以及不同稀释度之间更换或对玻璃棒进行灭菌。
4. 平板干燥数分钟后，倒置并放入37 °C培养箱中过夜培养。倒置平板可防止冷凝水滴落到琼脂表面。过夜培养后，应将平板储存于冰箱中。

E.coli 培养物	待涂布的稀释度
T0	10-1	10-2	10-3
T1	10-1	10-2	10-3
T2	10-2	10-3	10-4
T3	10-3	10-4	10-5
T4	10-4	10-5	10-6
T5	10-5	10-6	10-7
T6	10-6	10-7	10-8
T7*	10-5	10-6	10-7
T8*	10-4	10-5	10-6

^*较低的稀释度考虑了因死亡期导致的菌体数量减少。

表3. 大肠杆菌（E. coli）培养物的涂布实验方案。

4. 菌落计数与平均世代时间的计算

1. 检查平板上菌落的均匀性及有无污染。
2. 对每个时间点（T₀ 至 T₈），选择一个含有 30 至 300 个菌落的稀释度，并对三份重复平板进行计数。
3. 根据稀释倍数，反推原始培养液在 T₀ 至 T₈ 各时间点每毫升中的细胞数量。例如，若 10^-4 稀释度产生的菌落数分别为 30、28 和 32：
   平均菌落数 = 30 个菌落
   这些菌落来自 0.1 mL 的 10^-4 稀释液
   每毫升菌落数 = 30 x 10⁴ = 3 x 10⁶
4. 绘制 log₁₀ CFU/mL 随时间（小时）变化的曲线图。
5. 从图中确定对数生长期。选取对数生长期内的两个时间点及其对应的细胞数量，计算平均世代时间。