利用RT-PCR对环境样品进行RNA分析

1. 样品采集：土壤样品

1. 通过 GPS、坐标或目视方式确定采样地点。
2. 进行随机采样时，可在区域内选择随机点，以获得微生物生境的总体普查数据。样线采样则沿一条直线上的多个点进行采集，e.g.，在溪流床附近。网格采样是在规则间隔的点上系统地采集样本，适用于对未知或变异区域的微生物群落进行绘图分析。
3. 在 3–6 英寸（7.5–15 cm）深度范围内采样，可获取根际附近但不处于根际内部的最活跃微生物活动区域（根际是指直接受植物根系及其相关微生物影响的狭窄土壤区域）。
4. 采集土壤样品时，将手动钻具插入地面并旋转，直至达到预定深度。
5. 提起钻具，土壤将保留在钻具的空心杆内。
6. 将钻具底部的土壤刮入土壤采集袋中，注意避免用手接触或污染土壤。
7. 在采集袋上正确标注采样地点、名称、日期和时间。
8. 在实验室中，将土壤样品通过 2 mm 筛网，以去除碎石和岩石。
9. 取部分土壤样品分析其含水量。有关此步骤的详细信息，请参阅 JoVE 科学教育视频中关于土壤水分的内容。

2. 样品采集：水样

1. 通过 GPS、坐标或目测确定采样地点。
2. 用储存瓶采集水样，记录所采集水样的体积；若需对样品中的微生物进行定量分析，则可根据采集的体积计算微生物浓度。
3. 使用适当的电子探针立即检测实验所需的各项水质参数（如温度、pH、电导率、盐度、氮和磷含量等）。
4. 将装有水样的瓶子放入装有冰块的冷藏箱中，并将冷藏箱转移至实验室。

3. RNA 提取

1. 为从环境样品中收集并浓缩微生物，请参考 JoVE 科学教育视频中的群落核酸提取方法。
2. 根据制造商说明书，使用商业RNA提取试剂盒从病毒中提取RNA。
3. 简而言之，首先将样品与添加了乙醇的裂解缓冲液混合，然后将混合物加入离心柱中。
4. 以约 12,000 × g 离心，弃去穿流液。向离心柱中加入洗涤缓冲液，再次离心。
5. 向离心柱中加入无RNase水，离心30秒，以将RNA洗脱至无菌的1.5 mL低吸附微量离心管中。

4. 逆转录-PCR

1. 从 -20 °C 冰箱中取出以下试剂：dNTP、浓缩液（例如，10x 反转录缓冲液、引物（本示例中为随机引物）。在洁净超净台内冰上或室温解冻，并在解冻后始终保持冰上放置。同时取出反转录酶和RNase抑制剂，并置于冰上保存。
2. 计算配制“主混合液”所需的试剂体积，该混合液包含所有反应中保持不变的试剂（参见 表1 用于一个样本反应）。为每个样本以及阳性对照（使用已知转录本模板）和阴性对照准备足够的混合液例如，不加逆转录酶，仅以水作为模板等）反应。总体积增加10%。
3. 在1.5 mL低吸附微量离心管中配制预混液。这可最大限度减少试剂分子与管壁塑料的结合。
4. 试剂解冻后，将计算好的体积加入微量离心管中。每次加入前需轻轻涡旋并离心各管。添加每种试剂时务必更换移液器吸头，以防止污染。
5. 所有试剂加入后，涡旋混匀并离心主混合液，以确保混合均匀。将试剂放回-20 °C保存。
6. 准备并标记8联管PCR管条，每个管子分别用于一个样本或对照反应。
7. 将等体积的主混合液分装至各试管中。然后加入反应特异性的组分，例如RNA提取物。
8. 将八联管盖牢固地盖在PCR八联管上，使用配备八联管转子的小型离心机离心，确保所有液体聚集于各管底部（图2).
9. 将PCR条带牢固放入热循环仪中，按压以确保管子固定到位。
10. 将热循环仪设置为适用于所用逆转录（RT）反应的程序（参见 表2 按照示例方案操作完成后，离心管中将含有cDNA产物，可直接用于PCR扩增。具体细节请参考JoVE科学教育视频中关于PCR和定量PCR的内容。cDNA产物请于-20 °C保存，直至使用。

图 2. 含有预混液和提取物的带盖 8 孔管条。

试剂	每反应体积 (μL)
10x RT Buffer	2.0
25x dNTPs	0.8
10x 随机引物	2.0
Multiscribe	1.0
Rnase 抑制剂	1.0
分子级 H2O	3.2
总体积	10

表1. 逆转录主混合液成分。

步骤 1	步骤 2	步骤 3	步骤 4
25 °C , 10 min	37 °C , 120 min	85 °C , 5 min	4 °C , ∞

表2. 逆转录反应热循环仪程序。