高效液相色谱法（HPLC）

1. 配制流动相

1. 通过将400 mL乙腈加入约1.5 L纯化去离子水中，配制流动相。
2. 小心地向该溶液中加入2.4 mL冰醋酸。
3. 用纯化去离子水在容量瓶中将溶液稀释至总体积2.0 L。所得溶液的pH值应在2.8至3.2之间。
4. 使用校准的数字pH计，逐滴加入40%氢氧化钠溶液，将pH值调节至4.2。当pH值达到4.0后，应非常缓慢地添加，整个过程大约需要50滴。
5. 在真空条件下，将流动相通过0.47 µm尼龙66膜过滤器过滤，以脱除溶液中的气体并去除可能堵塞色谱柱的固体颗粒。对流动相进行脱气至关重要，可避免产生气泡，否则气泡可能在色谱柱入口处的固定相中形成空隙，或进入检测器池，导致紫外吸光度信号不稳定。

2. 配制组分溶液

需要配制的三种组分分别为咖啡因（0.8 mg/mL）、苯甲酸钾（1.4 mg/mL）和阿斯巴甜（L-天冬氨酰-L-苯丙氨酸甲酯）（6.0 mg/mL）。这些浓度在以相同方式稀释后，可使标准品的浓度达到碳酸饮料样品中的水平。

1. 将 0.40 g 咖啡因加入 500-mL 容量瓶中，然后用去离子水定容至 500-mL 刻度线。
2. 将 0.70 g 苯甲酸盐加入 500-mL 容量瓶中，然后用去离子水定容至 500-mL 刻度线。
3. 将 0.60 g 阿斯巴甜加入 100-mL 容量瓶中，然后用去离子水定容至 100-mL 刻度线。将该溶液置于冰箱中冷藏，以避免储存期间发生分解。

3. 配制7种标准溶液

这三种组分的分配系数各不相同，这影响了它们与两相相互作用的方式。分配系数越大，组分在固定相中停留的时间越长，导致其到达检测器所需的保留时间更长。

1. 根据表1中的图表，将每种组分的适当体积用移液管加入50 mL容量瓶中。
2. 用流动相将每种储备溶液稀释至50 mL容量瓶的刻度线。
3. 将每种标准溶液倒入样品架中标记好的小瓶中。
4. 将样品架中的样品以及50 mL容量瓶中剩余的溶液一同存放在冰箱中。

4. 检查高效液相色谱系统的初始设置

1. 确认废液管已接入废液容器，且未将流动相循环回用。
2. 确认流动相流速设定为 0.5 mL/min。该流速足以使所有峰在 5 分钟内洗脱，同时足够缓慢以获得良好的分离度。
3. 确认溶剂输送系统（泵）前面板上设定的最低压力、最高压力和流速均为正确数值。
   1. 最低压力设定值：250 psi（用于在发生泄漏时关闭泵）。
   2. 最高压力设定值：4,000 psi（用于在发生堵塞时保护泵，防止损坏）。
4. 按下检测器前面板上的“zero”按钮，以设定空白基线（空白即为纯流动相）。
5. 先用去离子水冲洗一支 100-µL 注射器，再用待分析的工作标准品溶液冲洗数次，并用该溶液充满注射器。首先分析 3 种单组分样品，以便识别各目标组分的色谱峰。

5. 手动进样及数据采集

1. 将进样器手柄置于加载位置，通过隔垫端口缓慢注入 100 µL 溶液。
2. 确认数据采集程序已设置为采集 300 s 的数据，以确保所有 3 个峰均有足够时间流经检测器。
3. 准备开始试验时，将进样器手柄旋转至进样位置（将样品注入流动相），并立即在计算机数据采集程序上点击“开始试验”。对于标准品 1-3，在运行过程中屏幕上仅出现三个连续峰中的一个（图 1）。
4. 当 300 s 结束后，数据采集程序会提示保存数据文件。将数据保存为合适的文件名（例如，STD#1）。
5. 记录每次试验中各峰的出峰时间（单位为秒），用于鉴定该组分。
6. 从隔垫中取出注射器，并对剩余的工作标准品重复上述过程，每次色谱运行时间与首次运行确定的时间相同。

图 1. 三种组分的色谱图。 从左至右分别为咖啡因、阿斯巴甜和苯甲酸盐。

6. 饮食型碳酸饮料样品

健怡可乐、健怡百事可乐和零度可乐为“未知样品”。这些样品已被置于敞口容器中过夜，以去除碳酸化气体，因为气泡对高效液相色谱系统不利。此步骤可充分去除样品中的所有气体。

1. 用塑料注射器吸取约 2 mL 的苏打饮料。
2. 通过 Luer-Lok 接口旋转拧紧滤膜针头至注射器上。
3. 将注射器中的液体推过滤膜，收集至小型玻璃小瓶中。此步骤可去除可能堵塞分离柱的不必要颗粒物。
4. 用等体积的去离子水稀释每个样品，使其纯度为 50%。
5. 将 100 µL 样品注入进样环中，并使用与标准品相同的参数运行检测。

7. 计算

1. 根据各组分溶液的浓度，结合为7个样品所进行的稀释操作，计算各标准品中所有组分的浓度。
2. 采用三角法测定各标准品及未知样品色谱图中的峰面积，该方法的计算公式为峰高乘以半峰高处的峰宽（图2）。在根据各组分出峰时间确定各色谱峰对应组分后，将测得的峰面积输入计算机电子表格中。
3. 以三种组分在各标准品中的峰面积对浓度（mg/L）绘制校准曲线。
4. 确定每条校准曲线的最小二乘拟合直线。
5. 根据样品HPLC检测所得的峰面积，计算各组分在无糖饮料中的浓度。注意：在注入HPLC系统前，无糖饮料样品已被稀释2倍。
6. 计算无糖饮料中各组分的含量，单位为mg/L。
7. 根据上述结果，计算每罐12盎司（oz）饮料中各组分的毫克数。假设12 oz = 354.9 mL。

图 2. 曲线峰高和峰宽的基本示例，二者需相乘（峰高乘以半峰高处的峰宽）。