标准曲线

1. 制备标准品：系列稀释

1. 配制标准品的浓缩储备液。通常准确称取化合物，定量转移至容量瓶中，加入适量溶剂，混匀使样品溶解，再用适当的溶剂定容至刻度线。
2. 进行系列稀释。取另一个容量瓶，用移液管加入所需体积的标准溶液，然后用溶剂定容至刻度线并混匀。通常进行十倍稀释，例如对于10 mL容量瓶，加入1 mL前一浓度的溶液。
3. 根据需要继续稀释，从前一溶液中吸取适量进行下一级稀释。为获得良好的校准曲线，至少需要5个不同浓度点。

2. 运行标准曲线样品和未知样品

1. 使用紫外-可见分光光度计检测样品，以确定绘制校准曲线所需的仪器响应值。
2. 取第一个样本的读数。建议以随机顺序运行样本（即 并非从高到低或从低到高）以避免系统误差。为估算噪声水平，需对任一样本重复测量3–5次。
3. 运行额外的标准样品，对每个样品重复测量以估算噪声水平。记录数据，以便后续绘图。
4. 运行待测样品。应尽可能采用与标准品相同的检测条件，即样品基质或缓冲液应保持一致，pH 值应相同，且浓度应在所用标准品的浓度范围内。

3. 绘制标准曲线

1. 将数据记录在电子表格中，并使用计算机程序绘制数据与浓度的关系图。如果每个数据点至少进行了三次重复测量，则可以绘制这些测量值的标准偏差作为误差棒，以估计每个数据点的误差。对于某些曲线，可能需要将其中一个坐标轴用对数形式表示才能得到直线。由于校准曲线所遵循的方程通常已预先知晓，因此当方程中含有对数项时，应采用对数坐标图。
2. 检查校准曲线。它看起来呈线性吗？是否存在某部分看起来非线性（即已达到仪器响应的极限）？为验证这一点，可使用软件将所有数据点进行线性回归拟合。如果决定系数（R²）不够高，可移除曲线上起始或末尾明显偏离直线的部分数据点，然后重新进行线性回归。不允许仅因中间的数据点误差棒较大而将其删除。通过此分析确定曲线中哪一部分是线性的。
3. 线性拟合的结果应为 y = mx + b 形式的方程，其中 m 为斜率，b 为 y 轴截距。斜率的单位为 y 轴单位/浓度，在本例（图1）中为 吸光度/μM。y 轴截距的单位与 y 轴单位相同。同时会得到决定系数（R²），R² 值越高表示拟合效果越好；完全拟合时 R² 为 1。软件程序还可能提供斜率和截距的误差估计值。

4. 结果：1号蓝色染料吸光度的标准曲线

1. 蓝色染料#1在631 nm处的吸光度校准曲线如下图所示（图1）。在0至10 µM范围内，响应呈线性。当浓度超过此范围时，信号趋于平缓，因为此时响应已超出紫外-可见分光光度计的线性检测范围。
2. 计算检测限（LOD）。根据校准曲线的斜率，LOD = 3×标准偏差（噪声）/斜率（m）。对于该校准曲线，噪声通过重复测量值的标准偏差获得，为0.021。因此，LOD为3×0.021/0.109 = 0.58 µM。
3. 计算定量限（LOQ）。LOQ = 10×标准偏差（噪声）/斜率（m）。对于该校准曲线，LOQ为10×0.021/0.109 = 1.93 µM。
4. 计算未知样品的浓度。利用校准曲线的直线方程计算未知样品的浓度。仅当未知样品的测量值落在标准样品的线性范围内时，该曲线才有效。若读数过高，则可能需要进行稀释。本示例中，未知运动饮料样品被1:1稀释。测得吸光度为0.243，对应浓度为2.02 µM。因此，该运动饮料中蓝色染料#1的最终浓度为4.04 µM。

图1. 蓝色染料的紫外-可见光吸光度校准曲线。左图：测定了不同浓度蓝色染料#1的吸光度。当浓度超过10 µM、吸光度大于1时，响应趋于平缓。误差棒来源于同一样品的重复测量，表示标准偏差。右图：校准曲线的线性部分拟合为一条直线，方程为 y = 0.109*x + 0.0286。未知样品的数据以黑色表示。请点击此处查看该图的放大版本。