环境样品中噬菌体的检测

1. 采集含有大肠噬菌体的污水或水样。
2. 使用Tris缓冲液将样品稀释1:10和1:100。具体操作为：将1.0 mL样品转移至9 mL Tris缓冲液中，然后进行第二次10倍稀释。
3. 通过蒸汽浴或高压灭菌器将三管软琼脂（每3 mL管含0.7%营养琼脂或胰蛋白胨大豆琼脂）融化。
4. 将融化的琼脂置于45–48 °C水浴中15分钟，使其温度平衡至45 °C。
5. 向第一管中加入1 mL处于对数生长期的E. coli¹液体培养物和1 mL未稀释的样品。
6. 从水浴中取出试管，轻轻在双手间摇动2–3秒，使悬液混匀。
7. 用纸巾擦干试管外壁的水分，然后将琼脂倾注于预先制备好的含有底层琼脂（普通营养琼脂或胰蛋白胨大豆琼脂）的培养皿上。
8. 迅速旋转培养皿，使顶层琼脂均匀铺展，确保完全覆盖整个表面。
9. 对另外两管软琼脂重复步骤5–8，分别加入1 mL细菌培养物和1 mL各稀释度的样品（图2）。
10. 待琼脂凝固后，将培养皿倒置，在37 °C下孵育48小时。轻轻敲击培养皿盖以去除冷凝水；若水滴落入噬菌斑区域，会导致病毒在琼脂表面扩散。
11. 孵育结束后，计数各稀释度平板上的噬菌斑数量（图3），并计算原始样品中噬菌体的浓度。记录噬菌斑在大小或形态上的任何显著差异。

图2. 利用顶层琼脂制备细菌草坪以进行大肠噬菌体计数的操作流程。

图 3. 细菌菌苔上的噬菌体噬斑。

¹E. coli 菌株 ATCC 15597 通常能从污水样本中产生最多的噬菌斑。该菌株应在含有 100 mL 营养肉汤或胰蛋白胨大豆肉汤的 250 mL 锥形瓶中过夜培养，并在 35 °C 条件下振荡孵育。在进行噬菌体检测前 3 小时，将 1 mL 该培养物接种至另一含有 100 mL 营养肉汤或胰蛋白胨大豆肉汤的新锥形瓶中，并置于 35–37 °C 的振荡水浴中。这可确保细菌处于对数生长期。