标准加入的方法

标准添加法是一种定量分析技术，用于最大限度地减少干扰分析物测量信号的基质效应。

未知组分浓度通常通过一系列分析技术进行阐明，例如光谱法、质谱法和电化学法。但是，测量可能会受到样品中其他成分（称为矩阵）的影响，并导致信号的无意中减少或增强，称为矩阵效应。这些效应可能会使结果出现偏差，并导致分析中出现重大错误。

加入方法可用于最大限度地减少基质对测量信号的影响。这是通过向样品中加入精确体积的已知分析物溶液来实现的。

本视频将介绍标准品添加法的基础知识，并演示如何在实验室中使用荧光测量来执行该技术。

基质效应可能出现在许多其他分子与分析物相互作用的复杂样品中。例如，当分子与分析物结合或团聚时，就会发生这种情况，从而改变其荧光能力。或者基质可能会改变整体溶液的离子强度，从而改变分析物的特定性质。

为了使用标准品添加方法减轻这些影响，将一系列体积的分析物标准溶液添加到等体积的样品中。然后使用溶剂使溶液体积相等。

然后，测量添加和添加标准品的样品的信号。数据绘制为强度与添加到样品中的标准品量的关系，而不是经典的校准曲线。任何给定烧瓶中分析物的实际浓度由以下公式定义。仪器响应将等于分析物浓度的某个常数乘以。得到的方程采用线性形式 y=mx+b。因此，当图外推到零吸光度时，截距等于样品的未知浓度。

信号图在关注的浓度范围内必须是线性的。此外，干扰不应随着分析物与样品基质的比率变化而变化。最后，矩阵本身不应自行生成任何测量信号。

以下实验通过将铝与 8-羟基喹啉或 8HQ 反应形成荧光 ALQ3 复合物来研究铝（一种非荧光物质）。

测量铝络合物在有机溶剂中的荧光，然后与原始铝溶液的浓度相关联。这种方法在金属离子分析中很常见。

现在，标样添加法的基础知识已经概述过，实验的基础知识也已经解释了，让我们在实验室中执行该技术。

首先，在水中制备 100 ppm 的铝储备溶液，然后用它来制备 1 ppm 的标准溶液。

接下来，向 100 mL 容量瓶中加入 2 g 8-羟基喹啉或 8HQ。

小心加入 5.74 mL 冰醋酸，然后用去离子水稀释至 100 mL 标记。此步骤使 8HQ 能够在水相中溶解。

接下来，将 20 g 乙酸铵和 7 mL 30% 氢氧化铵加入 100 mL 标记瓶中并稀释，以制备缓冲液。用 pH 指示棒验证 pH 值。该缓冲液混合时有助于中和 8HQ 溶液中的酸。

所需的其他试剂包括无水硫酸钠和分光光度级氯仿。

现在准备样品，在本例中，使用液-液萃取将水性样品提取到有机相中。将 6 个 125 mL 分离漏斗放在通风橱内的环形支架环上。确保所有玻璃器皿都一丝不苟地清洁，因为脏的玻璃器皿会扭曲结果。按顺序标记漏斗 "blank"、"0"、"1"、"2"、"3" 和 "4"。

使用移液管，将 25 mL 未知铝溶液添加到标记为"0"到"4"的五个分离漏斗中。向标有"空白"的漏斗中加入 25 mL 去离子水，制备空白。

接下来，将 1 mL、2 mL、3 mL 和 4 mL 的 1 ppm 标准溶液加入相应的编号漏斗中。不向空白漏斗或 0 漏斗添加标准解决方案。

向 6 个漏斗中的每一个漏斗中加入 1 mL 的 8HQ 溶液和 3 mL 的缓冲溶液。

通过向每个培养瓶中加入 10 mL 氯仿进行液-液萃取。用力摇晃漏斗，偶尔将漏斗通风以释放压力积聚。将漏斗放回环中，让液体层分离。

接下来，将氯仿相收集在干净、干燥并贴有标签的 100 mL 烧杯中。由于氯仿的密度高于水，因此它是漏斗中的下层。

将氯仿提取物转移到 25 mL 容量瓶中，并盖上每个烧瓶以防止蒸发。

向每个漏斗中加入 10 mL 氯仿，对剩余的水溶液进行第二次液-液萃取。像以前一样摇动漏斗，将任何剩余的分析物转移到氯仿相中。顶部水相中不应留下黄色。

对每个漏斗重复第二次提取，然后在相应的标记烧杯中收集氯仿相。将收集的氯仿倒入各自的容量瓶中，并用新鲜的氯仿稀释至刻度。

要去除微量水，向六个 100 mL 烧杯中加入约 1 g 无水硫酸钠。将溶液转移回各自的烧杯中，并旋转以促进样品脱水。

将氯仿提取物倒入石英荧光计池中。

根据制造商的说明设置荧光计，并将电压设置为 400 V。接下来，在计算机上打开数据采集程序。

使用样品 2 确定最佳激发波长和发射波长。将发射波长设置为 500 nm，并从 335？435 nm 运行激发扫描，扫描速度为 2 nm/s。

从荧光图中，确定激发的最长。将仪器设置为该激发波长值，在本例中为 399 nm。

接下来，通过从 450-550 nm 执行扫描来确定发射波长。从得到的荧光图中，确定最长并设置发射波长，在本例中为 520 nm。

测量每个样品，包括所选激发和发射波长处的空白样品。记录每个荧光强度读数。

从其他 5 个样品中减去空白样品的测量荧光。

绘制五个样品中每个样品的荧光强度与添加到样品中的铝量的关系。确定结果图的最小二乘值，并记录斜率和截距。

荧光强度与添加铝量的关系图产生了一条最小二乘线，如图所示。然后可以使用这条线计算样品中的铝含量。由于未知添加量为 25 mL，因此确定的值 2.916 ？g？除以 25 mL。最终结果为 0.117 ？g/mL，即 0.117 ppm。这与已知的 0.110 ppm 值非常接近。

现在，让我们看看其他一些分析技术，这些技术可能会因矩阵效应而产生偏斜的结果。

原子吸收光谱法是一种测量目标分析物在气相中对光的吸光度的分析方法。对于大多数样品，将吸收与样品浓度相关联的简单校准曲线可以作为定量未知浓度的可靠方法。

但是，如果混合物的其他组分与目标分析物相互作用并抑制或增强吸收，则该技术可能会失去准确性。在这种情况下，可以使用标准加入法来解释这些相互作用的影响，尤其是在分析前无法去除基质的样品中。

仪器校准对测量的准确性起着至关重要的作用。标准添加方法通常用于帮助校准 ICP-MS 等仪器。ICP-MS 是一种比较方法，这意味着未知样品的测量基于化学标准品的测量。

因此，未知物测量的不确定度不能优于校准的不确定度。因此，标准添加方法可用于创建比标准方法更准确的校准曲线，并考虑样品中的基质相互作用。

许多生物分子使用高效液相色谱法 （HPLC） 进行分析。HPLC 是一种根据分子特性（如极性、电荷和大小）分离和分析复杂混合物的技术。分析物离开色谱柱的时间使用户能够识别混合物中的每种组分。

生物分子通常可以在混合物中相互作用，并且受它们悬浮的基质的很大影响。通常，标准加法用于创建解释这些影响的校准曲线。

您刚刚观看了 JoVE 对标准加法方法的介绍。现在，您应该了解如何使用该技术来解释样品分析中的基质效应。

感谢观看！