3.11: 毛细管电泳 (CE)

1.行政长官仪表安装程序

1. 打开 CE 仪器和计算机。使用计算机软件，打开光源紫外分析允许它暖和起来。一些软件有指示器灯可供使用时 （灯图标变成彩色）。
2. 使方法文件。设置运行 CE 的重要参数。在这种分析的墨盒和样品的储存温度是 35 ° c。紫外检测波长是 214 nm。
3. 写一个时间程序。程序通常由冲洗步骤 （清洁前分析毛细管）、 注射的步骤，然后电泳步骤组成。冲洗的步骤，执行 2 冲洗 1 分钟使用 20 磅/平方英寸的压力。第一次漂洗是用 NaOH，有助于确保在毛细血管壁上的硅烷醇是并去质子。第二次冲洗是与运行缓冲区 （这里 0.025 M 硼酸缓冲） 以确保毛细管左平衡与缓冲区。
4. 注射压力注射用于 0.5 磅/平方英寸 5 s。
5. 电泳法的步骤，条件是分离电压: 20 千伏，时间: 5 分钟，正常的极性。每一步，也表明哪瓶是入口，哪瓶是出路。保存方法文件后输入所有的参数。

2.标准和苏打水样品的制备

1. 使水中的阿斯巴甜，咖啡因和苯甲酸 500 ppm 股票解决方案。使 50 毫升的每一个，使用容量瓶。
2. 在 10 毫升容量瓶中，让 150 ppm 阿斯巴甜、 150 ppm 咖啡因和苯甲酸 100 ppm 标准解决方案。
3. 在 10 毫升的容量瓶中使 50 ppm，100 ppm，150 ppm 和 200 ppm 标准咖啡因解决方案。

3.在 CE 上运行样本

1. 放入样品瓶架包含标准或苏打水样品瓶。请务必写下的样本是在哪个插槽中。两个插槽有硼酸运行缓冲区和 0.1 M 氢氧化钠冲洗液。
2. 在方法文件中，输入第一个样品瓶是在哪个插槽。
3. 获得一次的运行，并确保正确输入所有的数据信息的程序的请求。
4. 继续获得数据，更改每个样本输入小瓶。运行组合标准、 3 种浓度的咖啡因和百事可乐、 饮食百事可乐样品。
5. 插入该文书的目标和选择适当的文书。
6. 分析计算机上的数据。计算峰面积和覆盖标准和实际的示例，以帮助确定峰。使咖啡因数据校准曲线。

毛细管电泳 （CE） 是一种用于化学分析的技术，用于根据大小和电荷在电场中分离分子。

毛细管电泳在亚毫米直径的管子（称为毛细管）中进行，该管子包含流动的电解质溶液。将样品注入毛细管，并施加电场。然后根据分子的速度差异分离分子，该速度受电荷、大小和溶剂粘度的影响。CE 是分离带电分子的理想选择，并且比高效液相色谱具有更高的分离度，使其更高效、更灵敏。

本视频将介绍毛细管电泳的基础知识，并通过测定软饮料的成分来演示其应用。

在 CE 中，电场被施加到充满电解质的毛细管上。电场在毛细管入口处感应出正电荷，在出口处感应出负电荷。

电解质在毛细管内流动，由电场感应。这种流动称为电渗流，是由带负电荷的盐离子离散层沿带负电荷的毛细管壁移动引起的。

当电流流过毛细管时，沿壁的阳离子向负端移动。该离子流将中心的溶液拉过管。

然后根据样品分子在毛细管内的速度分离样品分子。这种速度称为电泳迁移率，取决于分子的电荷和大小，以及它被电场吸引或排斥的程度。

带正电的分子流过毛细管的速度更快，因为它们更容易被出口处的电位所吸引。带负电的分子流动得更慢，因为它们更容易被入口处的电位所吸引。中性分子随本体流携带。因此，离开毛细管的分子顺序是带正电、中性，然后带负电。此外，由于摩擦力，电解质流拉动较小分子的速度比拉动较大分子的速度快。

分子离开色谱柱时由 UV-Vis 等检测器记录，并在检测器信号强度与时间的关系图中可视化，称为电泳图。

电泳图可以产生一系列信息;例如样品中存在多少种不同的化合物以及每种物质的含量。

现在您已经了解了毛细管电泳的简要概要，让我们来看看它在实验室中是如何进行的。

首先，打开毛细管电泳仪和计算机。然后打开 UV 检测器让它预热。

设置用于运行 Experiment 的参数。首先，将小柱和样品储存的温度设置为 35 ？C 和 UV 检测波长为 214 nm。

接下来，设置两个漂洗步骤。第一次冲洗是用氢氧化钠，以确保毛细血管壁上的硅醇基团被质子化。第二次冲洗使用电泳缓冲液来平衡毛细管。然后，将样品设置为在 0.5 psi 下进样 5 s。

通过选择分离电压来设置电泳步骤。在这种情况下，使用正常极性使用 20 kV 5 分钟，这意味着入口处的电场为正，出口处的电场为负。

首先，在水中制备 50 mL 苏打成分阿斯巴甜、咖啡因和苯甲酸的储备液，浓度为百万分之 500。

从储备液中，制成 150 ppm 阿斯巴甜、150 ppm 咖啡因和 100 ppm 苯甲酸的标准溶液。

然后，制作 4 种咖啡因的标准溶液，浓度为 50、100、150 和 200 ppm。这些样品将用于制作校准曲线。有关更多信息，请参阅此集合中有关校准曲线的视频。

最后，通过用氮气脱气来制备苏打样品。苏打水样品将在不稀释的情况下进行分析。

将装有标准样品或苏打样品的样品瓶放入样品瓶支架中。将含有电泳缓冲液和氢氧化钠冲洗液的小瓶也放入样品架中。确保记录每个位置。

在 CE 仪器软件中，指示哪些插槽包含两个冲洗液和第一个样品瓶。现在，运行第一个示例。

然后，通过更换起始样品瓶来运行组合标准品、4 种浓度的咖啡因以及普通样品和无糖苏打水样品。

分离所有解决方案后，分析数据。

首先，使用标准品鉴定苏打水样品中的峰。将无糖汽水样品中观察到的三个峰与标准品进行比较，表明无糖汽水中存在咖啡因、阿斯巴甜和苯甲酸。在普通苏打水样品中，仅存在咖啡因峰，而不存在阿斯巴甜和苯甲酸峰。

然后，计算每种咖啡因标准溶液的峰面积，并绘制校准曲线。咖啡因的校准曲线可用于计算每个样品中咖啡因的浓度。

毛细管电泳用于学术和工业环境中的许多专业分离。

CE 通常用作制药行业质量控制测试的一个组成部分。药物，无论是小分子还是生物制剂，都可以通过毛细管电泳进行，以查看是否存在任何副产物。它也可以用于确定蛋白质是否正确折叠，因为折叠会影响蛋白质电荷。

CE 也可用于分离 DNA。使用微孔板和多个毛细管阵列，研究人员可以提高单个实验的通量，如下所示。根据大小分离 DNA 片段，分辨率低至 1 个碱基对。这使得对 DNA 片段进行测序以及确定其他参数成为可能，例如用于诊断潜在遗传疾病的拷贝数变体。

蛋白质可以通过化学连接到不同位置的各种官能团进行修饰。同一蛋白质的不同拷贝可能会因不同的修饰而变化，这将改变每种蛋白质的电荷和大小。通过连接到质谱仪的 CE 运行纯化的蛋白质可以根据存在的修饰来分离蛋白质，还可以识别修饰的类型和位置。

您刚刚观看了 JoVE 对毛细管电泳的介绍。您现在应该了解 CE 如何根据电荷和质量分离分子，以及如何在实验室的 CE 上运行样品。

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