血液采集 I

此处所述的所有动物实验操作必须遵循机构动物伦理指南，并经IACUC批准。所有操作须遵守3R原则——替代（Replacement）、减量（Reduction）和优化（Refinement），并由经过培训的人员执行。

1. 尾静脉采血

1. 设备
   1. 塑料固定架
   2. 带橡胶塞的真空采血管
   3. 双头（蝶形）针头（22G）
   4. 放大眼镜
   5. 浸有70%乙醇的棉球
   6. 温水（20–30°C）
2. 固定
   1. 将小鼠放入塑料固定架中。
   2. 前肢和后肢应舒适放置，以尽量减少应激和移动。
   3. 尾部伸直并保持固定，以便采样。
3. 采血
   1. 使用吸入性麻醉剂（如异氟烷）在钟形罩或气体麻醉诱导室中对动物进行麻醉，直至达到有效麻醉深度。
   2. 动物完全麻醉后，将其取出并置于侧卧位。
   3. 通过将手指置于头部上方并沿下颌线向下施力，向后下方牵拉皮肤，使眼球突出。
   4. 避免对气管施加压力，以免导致气道塌陷或阻塞，引起窒息死亡。
4. 尾静脉采血
   1. 用温水（20–30°C）清洗尾部，以促进血管扩张。切勿使用热水。
   2. 随后用70%乙醇擦拭尾部表面，清洁皮肤并进一步增强静脉可见度。
   3. 选择一条侧尾静脉进行采样。轻轻抓握并固定尾部下段。可使用放大眼镜以改善静脉的可视化效果。
   4. 将22G蝶形针头以约10°的角度插入尾部侧面静脉，进针位置约为距尾尖一半处，针头方向朝向尾根部，以便重复采样。
   5. 将针头的橡胶端插入采血管，利用真空负压收集血液。
   6. 可根据批准的实验方案从尾部获取多个样本。进行微量采血时，使用细针穿刺侧尾静脉，以获得小体积且可控的血液样本。

2. 尾部剪取

1. 设备
   1. 小动物固定器（已消毒）
   2. 锋利的手术剪刀（或 preferably 无菌手术刀片）
   3. 肝素化毛细管
   4. 吸球
   5. 含钾 EDTA 的微量采血管（已标记）
   6. 异丙醇
   7. 局部麻醉霜
   8. 无菌纱布或棉签（用于止血）
2. 固定
   1. 将小鼠轻柔地放入已消毒的固定器中。
   2. 固定固定器以尽量减少操作过程中小鼠的移动。
   3. 调整尾巴位置，以便于接触尾尖。
3. 采血
   1. 使用新鲜的异丙醇清洁尾巴。根据需要在尾尖涂抹局部麻醉霜。
   2. 使用锋利的剪刀（或 preferably 手术刀片），切除约 0.5–1 mm 的尾尖组织。
   3. 直接将血液收集至肝素化毛细管中（约 80 µL）。
   4. 使用吸球将收集的血液转移至标记好的含钾 EDTA 微量采血管中。轻轻倒置试管约 20 次，以防止凝血。
4. 止血与恢复
   1. 通过使用无菌纱布对尾尖施加轻柔压力，直至出血停止，以控制出血。
   2. 如有需要，可谨慎使用其他方法（如电灼或止血剂）以达到止血效果。
   3. 在将动物放回饲养笼之前和之后，必须对其进行监测，以确保实现止血。​

3. 心脏采血

1. 设备
   1. 对于小鼠，推荐使用带有22-25号×1英寸针头的3 cc注射器。较小的注射器无法提供相同的回压，可能导致采血更加困难。小于25号的针头会限制血液流动，导致凝血增加并损伤血细胞。短于1英寸的针头从膈肌进针时可能无法到达心脏水平。
   2. 对于大鼠，推荐使用带有18号×1.5英寸针头的10-12 cc注射器。根据大鼠体型的不同，较小的注射器可能无法容纳全部待采集的血量，因此在操作过程中需要更换注射器。小于20号的针头会限制血液流动，导致凝血增加。短于1.5英寸的针头从膈肌进针时可能无法到达心脏水平。
   3. 使用足够大小的采血管来盛装采集的血液。
2. 固定
   1. 正确的固定对该方法的成功至关重要。应抓住动物颈背部皮肤，使身体垂直悬垂。必须保持身体笔直，以防止心脏偏移或胸腔扭曲。
   2. 另一种可选体位是仰卧位，此时将针头插入动物左侧肋骨之间。该体位特别适用于体型非常大的大鼠，或需要对多只动物进行采血的情况。

图1. 小鼠垂直持握状态下的心脏采血。

3. 采血
   1. 从后方入路，穿刺膈肌时，若将小鼠或大鼠用颈背部皮肤垂直抓握，操作更为方便。
      1. 将针头向前推进至动物剑突左侧的切迹处。
      2. 针头应与脊柱平行，并置于肋骨稍下方。
      3. 心脏的位置大约与肘部齐平。
      4. 将针头斜面向上插入胸腔，并穿刺心脏。
      5. 用注射器施加轻微的负压。若针头位于心脏内，血液将流入注射器。
      6. 待血液充满注射器后，再增加额外的负压。
   2. 从动物左侧进行侧向入路时，需将动物置于仰卧位。
      1. 穿刺点的定位以胸壁上肘部对应点为参照。心脏的位置大约与肘部齐平。
      2. 针头在胸壁中点处垂直于实验台平面插入，该中点为背腹方向测量所得。
      3. 将针头斜面向上插入胸腔，并穿刺心脏。
      4. 用注射器施加轻微的负压。若针头位于心脏内，血液将流入注射器。
      5. 待血液充满注射器后，再增加额外的负压。

图 2. 小鼠仰卧位时的心脏采血。

4. 技术提示
   1. 正常心脏的位置为心尖朝向左侧。在极少数情况下，心脏可能呈反位，导致穿刺心脏困难。
   2. 注射器上施加过大的回抽压力可能导致心脏塌陷，堵塞针尖斜面，从而阻止血液流入注射器。
   3. 反复施加并释放回抽压力将引发注射器内血液凝固。
   4. 轻柔压迫肝脏可促使更多血量进入循环系统，从而可供抽取。

4. 眼后静脉丛采血

眶后采血是一种侵入性技术，通常应在适当的麻醉下进行，以最大限度地减少疼痛和痛苦，因为即使由技术熟练的操作者实施，也可能出现明显的不良反应。在许多实验方案中，尤其是当该操作为终点操作时，需要进行深度（终点）麻醉。对于非终点或重复采血，可采用较浅的麻醉而非终点麻醉；然而，此类操作必须经过充分论证，并明确获得机构伦理委员会/动物照护与使用委员会（IACUC）的批准，同时需充分考虑动物福利及累积影响。

1. 设备
   1. 准备一个麻醉诱导室，用于输送麻醉气体（如异氟烷）。若使用钟形罩，必须确保液态麻醉剂不与动物接触，以避免经皮肤吸收。可使用带小孔的平台。
   2. 推荐使用容量为 50–75 微升的微量压积管。采用聚酯薄膜包裹的压积管在操作者手指间更不易破裂，应视为一项安全措施。
   3. 在操作台面上放置数层纸巾或其他隔热材料，以在操作过程中维持动物体温。
2. 动物的准备与体位摆放
   1. 将动物置于钟形罩或气体麻醉诱导室内，使用吸入性麻醉剂（如异氟烷）进行麻醉，直至达到有效麻醉深度。
   2. 动物完全麻醉后，将其取出并置于侧卧位。
   3. 通过将手指置于头部顶部及下颌边缘，向后下方牵拉皮肤，使眼球突出。
   4. 避免对气管施加压力，以防压迫或阻塞气道，导致窒息死亡。
3. 采血
   1. 将微量压积管插入眼内眦，沿鼻部平面以 30–45° 角向尾侧方向插入。
   2. 在轻柔旋转压积管的同时施加压力，以切开结膜膜并破裂眶静脉丛。
   3. 血液将通过毛细作用流入压积管内。
   4. 避免插入过深，以免触及眼窝后部的骨骼。
   5. 一旦开始出血，应持续施压以保持眼球突出状态。
   6. 若需采集多管血液，无需将下一根压积管再次插入眶静脉丛，因血液会持续从内眦流出，可直接收集。
   7. 为停止出血，松开皮肤，使眼球恢复至正常位置。闭合眼睑，并对眼球轻柔加压约 30 秒，以促进止血。

图 3. 小鼠眼后静脉采血。

关键术语与定义
在采血操作之前，必须确定所需的样本类型。实验程序可能需要全血、血浆或血清。对于全血样本，必须向样本中添加抗凝剂。血浆是在红细胞分离后仍含有纤维蛋白原和其他凝血因子的液体成分，可从添加了抗凝剂的样本中提取。血清则是通过不加抗凝剂的血液采集获得。当血液形成凝块后，经离心即可得到血清。由于样本已经凝固，血清中不含纤维蛋白原及其他凝血因子。血浆和血清均需使用离心机以2200–2500 RPM转速离心至少15分钟才能获得。
若需获取全血或血浆样本，必须选用合适的抗凝剂。实验室动物常用的抗凝剂包括肝素、枸橼酸钠和乙二胺四乙酸（EDTA）；具体选择应根据研究需求而定。Sequester——EDTA、肝素和枸橼酸钠的液态形式——可直接注入注射器内壁进行预涂层处理，使抗凝剂在采血过程中立即与血液接触，有助于防止凝血。由于大鼠血液比大多数哺乳动物血液凝固更快，因此在采血时必须使用正确比例的抗凝剂与血液。
针头的选择取决于动物体型及穿刺部位。通常情况下，针头内径越大，采样速度越快。较大针头的另一个优点是可减少对血细胞的损伤。然而，大内径针头的主要缺点是可能对血管造成损伤。在小鼠和大鼠上，可选用20–29号、长度为0.5–1.5英寸的针头。如果针头过长，不仅使用不便，而且针管内多余的空间可能导致血液凝固。每种采血方法所适用的针头尺寸将在操作步骤部分列出。
所需样本量也必须预先确定。由于小鼠或大鼠体型较小，进行可存活采血时必须计算最大采血量。一只平均体重为25克的小鼠总血容量约为1.8 ml；一只平均体重为250克的大鼠总血容量约为16 ml。对于未进行液体补充的小鼠或大鼠单次采血，安全可移除的最大血容量为其总血容量的10%，或7.7–8 µl/g。因此，对于一只平均体重的小鼠，其总血容量的10%相当于193–200 µl；对于一只250克的大鼠，则相当于1.9–2.0 ml。研究表明，若移除超过总血容量15%的血液，可能导致低血容量性休克。然而，在进行液体补充的情况下，最多可采集总血容量的15%（即12 µl/g）。对于一只25克的小鼠，相当于300 µl；对于一只250克的大鼠，相当于3 ml。进行液体补充时，液体应预热并皮下给予。
若需多次采样，则每次采血量应减少。每周最大采血量不得超过总血容量的7.5%，或6 µl/g。对于一只25克的小鼠，相当于每周145–150 µl；对于一只250克的大鼠，相当于每周1.45–1.50 ml。若每两周采样一次，最多可采集总血容量的10%（8 µl/g），即平均体重小鼠每两周200 µl，250克大鼠每两周最多2.00 ml。一项针对平均体重250克大鼠的研究显示，当采血量达总血容量的15–20%时，血液指标恢复正常所需时间超过29天。对于重复采血，液体补充仅能恢复血容量，并不能允许采集更多血液或提高采血频率，因为动物需要时间重新生成血细胞。
过去，眶后静脉丛采血是一种常见做法。然而，该操作在人道性方面引发了诸多关注。操作过程中，一旦毛细管插入眼内眦后过度移动，可能损伤周围组织，导致眼睑和/或结膜膜肿胀。肿胀组织可能使眼球突出至眼睑无法闭合的程度，进而导致角膜干燥和损伤。肿胀引起的疼痛可能引发动物抓挠和自残行为，最终导致眼球摘除。若在眶后采血过程中毛细管放置不当，可能切断视神经，造成失明。若毛细管推进角度不正确，眼球可能被推出眼眶，导致眼睑滑至眼球后方。一旦发生这种情况，很难将眼球正确复位回眼窝。其他潜在问题还包括脆弱的眼眶骨骨折、眼球穿透导致玻璃体流失，或眼球后方形成血肿，因对眼球及周围结构产生压力而引起剧烈疼痛。尽管存在上述诸多问题，但如果由技术熟练的技术人员操作，并在全身麻醉（如异氟烷吸入麻醉）下充分麻醉动物，眶后采血已被证明是啮齿类动物有效的采血方法。
小鼠与大鼠的眼眶区域解剖结构有所不同。小鼠眼眶区域存在由血管汇集形成的眶后窦。而大鼠眼眶内虽也有血管丛流经眼球后方，但并不形成类似小鼠那样的窦状结构。因此，该操作在小鼠上更容易实施。通过眶后静脉丛进行重复采样时，两次采血之间至少需间隔10天，以确保局部组织充分愈合。虽然推荐使用全身麻醉，但在小鼠中若事先使用局部眼科麻醉剂（如丙帕卡因或丁卡因），也可在无全身麻醉下完成操作。由于大鼠不具备眶后窦结构，且其眼眶周围膜组织更为坚韧，因此进行该操作时必须实施麻醉。
通过尾尖剪切采集的样本可能同时含有动脉血和静脉血，并可能混入组织产物污染。若通过揉搓或“挤奶”方式获取更多血液，样本质量会下降。为增加血流量，可用温敷、加热灯或温水浸泡等方式对尾部加热。采血后应对尾尖施加压力以实现止血，并应每隔5–10分钟检查动物，确保已达成止血。重复采样时常出现止血延迟。可使用止血粉辅助止血。首次截尾操作建议使用麻醉（全身或局部），但后续采血通常无需麻醉，尤其是当动物已适应该操作时。麻醉会导致血压下降，从而增加此类采血技术的操作难度。
许多研究需要通过心脏穿刺放血（致死性采血）获取大量非存活样本。通过心脏穿刺，可从小鼠或大鼠体内采集约一半的总血容量。对于一只平均体重25克的小鼠，相当于40 µl/g或约1 ml血液；一只250克的大鼠则可获得约10 ml血液。放血操作必须在动物麻醉状态下进行。熟练技术人员可使用吸入麻醉，也可使用注射麻醉。但麻醉可能导致血压和循环下降，从而减少采血量。
心脏穿刺法可在动物麻醉后手动固定进行（闭合法），也可按照尾腔静脉采血法的方案外科暴露心脏后进行（开放法）。闭合法中，针头定位的解剖标志为动物左侧胸廓下缘与剑突交界处形成的凹槽。

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小鼠和大鼠的采血可通过多种技术实现。尽管采样量、采样频率以及动物的体型和年龄等多种因素均会产生影响，但最重要的因素是执行采样的技术人员的操作技能。对于本文所述的方法，正确使用麻醉剂对于获得高质量样本以及保障动物福利也至关重要。