离子交换色谱

1. 样品和色谱柱的准备

1. 在本实验中，将使用阳离子交换柱分离两种蛋白质的混合物：血红蛋白和细胞色素C。向蛋白质样品中加入0.2 mL平衡缓冲液（pH 8.1），涡旋振荡以充分混匀。离心2分钟以去除任何泡沫。
2. 将阳离子交换柱置于试管中静置5分钟，使树脂沉降。将装有柱子的试管用夹子固定在铁架台上，确保其保持垂直。
3. 打开柱子的上端盖，然后打开下端盖。让柱内的缓冲液在重力作用下滴入试管中。
4. 用一个柱体积的平衡缓冲液（本实验中柱体积为0.3 mL）洗涤柱子两次。加入第二个柱体积缓冲液之前，先让第一个柱体积（0.3 mL）的平衡缓冲液滴入废液管中。此步骤使柱子与平衡缓冲液充分平衡。此过程中应缓慢加入平衡缓冲液，避免扰动树脂。

2. 通过阳离子交换柱运行蛋白质样品

1. 将层析柱放入已标记为“未结合 1”的 2 mL 离心管中。小心地将 0.1 mL 蛋白质样品加至层析柱顶部。
2. 样品加样完成后，从柱顶加入 0.3 mL 平衡缓冲液进行洗涤，使其完全流过层析柱。重复此步骤 4 次（共洗涤 5 次），每次洗涤液分别收集于独立的 2 mL 离心管中。将这些离心管标记为“未结合 1-5”。
3. 最后两次洗涤时，在 1,000 × g 条件下离心 10 秒，以确保所有未结合的组分均被洗脱下来。任何与层析柱结合的样品不应出现在这些洗涤液中，而未结合的样品则会被洗脱并收集。离心可提供额外作用力，促进未结合物质从层析柱上脱离。
4. 将层析柱转移至一个新的、标记为“结合 1”的 2 mL 离心收集管中。在柱顶加入 0.3 mL 洗脱缓冲液（高盐，pH 5.5），然后以 1,000 × g 离心 10 秒，收集洗脱液。
5. 再重复洗脱步骤两次：每次将层析柱放入新的离心管中，加入 0.3 mL 洗脱缓冲液，并以 1,000 × g 离心 10 秒。将这两次收集的洗脱液分别标记为“结合 2 和 3”。
6. 记录各组分的颜色变化或其他观察结果。血红蛋白是一种有色蛋白，呈红褐色，而细胞色素 C 呈红色。

3. 结果：血红蛋白和细胞色素C的阳离子交换

1. 细胞色素C的等电点为10.5，血红蛋白的等电点为6.8。因此，当使用pH 8.1的平衡缓冲液时，由于血红蛋白带负电荷，不会结合到柱子上。而细胞色素C在此pH下带正电荷，会结合到柱子上，因为此时pH < pI。
2. 在未结合的组分中可观察到血红蛋白，因为它未与柱子结合。
3. 在结合组分中可观察到细胞色素C，因为它结合到了阳离子交换柱上。

图1. 未结合组分（血红蛋白）与结合组分（细胞色素C）的照片。