5.3: 育种和断奶的基本原理

1. 配对动物时所需的信息包括利用适当的命名法、繁殖雄鸟的出生日期和设置日期的动物的应变/存量。准确的记录保存是繁殖殖民地的当务之急。

2. 对小鼠和大鼠的性别测定是通过比较生殖器距离来完成的。在女性, 肛门和外生殖器之间的距离比男性短。阴囊在雄性动物中的存在是另一个性别指标。

3. 选择和建立交配方案

注意: 有两种交配方案可以使用。

1. Proestrus/发情定时交配: 这种方法依赖于在最大的接受度和生育力的情况下将雌性与雄性配对。
   1. 发情周期必须通过对外部生殖器的目测检查, 以观察 proestrus 和动情的变化, 或阴道分泌物的细胞学 (见下文)。
   2. 当雌性被确定为 proestrus 或发情时, 她在一天结束时与雄性配对, 因为动物通常在夜间交配。
   3. 第二天早晨, 女性被检查为一个交配插头 (见下文)。如果没有插头存在, 雌鸟可以留在白天的男性和检查一个交配插头在一天结束。另外, 如果确定她不再 proestrus 或发情, 她将从饲养笼中移除。
2. 随机定时交配: 这种方法是基于事实, 啮齿动物的动情周期是非常短的, 4-5 天长。
   1. 对于这种方法, 交配可以设置任何时候, 和女性, 然后检查交配插头, 每天早晚, 直到一个插头被观察到。
   2. 女性在晚上与男性配对。
   3. 她在每天的开始和结束时都要检查一个交配插头, 直到发现插头。使用此方法时, 通常需要3天或更长的时间才能看到插头。

4. 预测怀孕

因为小狗的触诊是困难的直到以后在怀孕期间, 大约10-12 天, 商业超声系统为啮齿目动物被开发了;然而, 很少有动物研究设施有这种技术。因此, 可视化的交配插头, 观察阴道的变化, 或阴道细胞学通常是用来协助预测的时候, 一个女性已受孕的垃圾 (见下文)。然而, 这些方法都不能证实怀孕。一旦观察到交配插头, 就应该对雌性进行监测, 以发现怀孕的迹象, 如体重增加。

5. 确定动情周期阶段

1. 目视检查
   注意: 对于小鼠和大鼠的定时交配, 观察阴道对 proestrus 和发情的变化是确定动情周期的最快方法, 无需特殊设备。
   1. 当用视觉方法评价发情周期时, 在同一个区域内对室内照明进行视觉检查是很重要的, 因为光源可以改变阴道组织的知觉颜色, 使评价变得困难。例如, LED 灯所投射的紫色色调使得视觉检测更加困难。
   2. 通过目测观察来评估动情周期的阶段, 每只老鼠都必须由尾巴手动约束, 前爪在笼盖上休息。
   3. 根据阴道周围组织的状况和阴道开口的大小, 对每个女性的阴道开口进行评估。²
      1. 在 proestrus, 阴道开口很宽, 其特征是周围组织肿胀。该组织是粉红色的颜色和非常潮湿。通常有皱纹或条纹沿背部和腹边的开口。
      2. 在发情期间, 阴道开口周围组织的肿胀减少, 组织不像湿润和粉红色。
      3. 在 metestrus 的阴道开口是最小的, 并有微不足道的肿胀。
      4. 在发情期间, 阴道周围组织没有肿胀, 阴道开口小且闭合。
2. 阴道细胞学
   由于小鼠和大鼠都是 polyestrous, 发情周期长很短, 从4-5 天不等。有时需要确定所有四阶段的发情: proestrus, 发情, metestrus, 和发情。阴道细胞学是一个非常准确的方法来确定这些阶段。还有两种标本采集方法: 无创阴道冲洗法和阴道穿刺法。
   1. 阴道灌洗
      1. 所需材料为无菌200µl 管提示, 乳胶灯泡, 无菌双蒸馏水 (ddH₂0), 和清洁玻璃幻灯片。
      2. 在无菌200µl 末端放置一个乳胶灯泡。在吸管中绘制大约100µl 的无菌 ddH₂O。
      3. 把老鼠从笼子里抬出来, 把她的尾巴放在铁丝网上。
      4. 牢牢抓住尾巴, 抬高老鼠的后腿。现在, 鼠标将只有前爪抓盖子。
      5. 如果鼠标小便, 等到排尿停止。如果阴道导管入口处有尿液, 则开口可以用 ddH 的小水枪冲洗₂o. 更改用于漂洗的笔尖。
      6. 将 ddH₂O 填充末端插入阴道导管的开口处, 而不穿透孔口。
      7. 在阴道导管开口处, 轻轻地压低灯泡, 将四分之一至一半的水 (约25-50 µl) 排出。液体会自发地吸入运河, 没有尖端插入。慢慢释放对灯泡施加的压力。液体会退到顶端。
      8. 避免释放压力太快, 以防止吸入液体进入灯泡。筛选的提示可能对此有用。
      9. 重复前面的步骤4-5 次使用相同的提示, 灯泡和流体, 以获得足够数量的细胞在一个单一的样本。
      10. 将液体放在玻片上, 使涂抹在室温下完全干燥。
      11. 为每只老鼠使用一个新的吸管。
      12. 一旦干燥, 这些动情的涂片可以立即染色或储存, 并在以后的日期染色。姬姆萨染色是最常用的着色幻灯片。这个污点是可利用的 one-step 污点, 不需要固定的幻灯片, 以防止细胞洗掉在染色过程中。根据制造商的说明, 幻灯片放置在污渍中45-60 秒。
      13. 然后在显微镜下对这些幻灯片进行检查, 所看到的细胞对应于周期的阶段: 1) 如果雌性在 proestrus, 那么细胞就被看成是圆形的、有核的上皮细胞的簇, 其细胞核的染色比细胞质;2) 如果雌性处于发情状态, 则大多数细胞是 cornified 鳞状上皮细胞, 缺乏细胞核, 呈角形, 并在密集的簇丛中发生;3) 如果雌性在 metestrus, 细胞通常是白色的血细胞 (特别是中性粒细胞与一些 cornified 鳞状上皮细胞存在) 与黑暗染色的细胞核, 形状像两个香肠连接在一起;4) 在发情期间, 存在的细胞通常是白细胞, 出现少数有核上皮细胞。
   2. 阴道拭物
      1. 所需要的材料是无菌棉签, 2 毫米直径尖端, 清洁玻璃显微镜幻灯片, 和无菌生理盐水。
      2. 用盐水沾上棉头的涂抹器。
      3. 将涂抹器的尖端插入受约束的鼠标的阴道。
      4. 轻轻地转动和滚动的尖端对阴道壁。小心地取下棉签。
      5. 通过在幻灯片上滚动拭子, 将电池转移到干燥的玻片上。
      6. 一旦该幻灯片是干的, 它可以染色与赖特姬姆萨染色。
         抽汲被认为是一个有压力的过程, 而且--当有压力的时候, 老鼠会扰乱发情周期。经抽吸引起的阴道和宫颈刺激可诱发假。反复拭子阴道粘膜可造成损害, 如果不轻轻地执行, 适当克制, 并与 correct-sized 棉签。³⁴

图2。阴道细胞学--啮齿动物发情周期的不同阶段

6. 可视化交配插头

这个插头包括阴道液和精子, 并坚持在阴道12-24 小时 postcopulation。该插头的存在证实交配, 但并不保证女性怀孕。如果被堵塞的女性怀孕了, 第一天的妊娠被认为是在插头被发现后的一天。

1. 把老鼠从笼子里抬出来, 把她放在铁丝网上, 把她的尾巴朝你放在上面。
2. 将鼠标放在尾巴上方施加压力, 使背部拱起, 以便更好地呈现阴道开口。
3. 观察她的阴道开口为一个白色的肿块。交配插头可能没有视觉上的明显, 但可以通过使用钝探针确认。
4. 使用探针的尖端, 轻轻地将其插入阴道开口。交配插头的存在将阻碍探头在阴道开口0.5 厘米内的推进。
5. 探头必须用酒精消毒, 并在每次使用前完全干燥。

由于雌性有凋落物、出生日期、产仔数、出生数量、断奶次数、男性: 母幼崽比例以及基因型的比例都应记录在案。如果垃圾中的基因型与亲本的基因型不符, 必须进行重新测试以验证真实基因型。

7. 断奶

小鼠和大鼠的妊娠期约为21天。年轻人在21-28 天的年龄断奶。小鼠和大鼠都可以在8周龄前繁殖, 因此幼崽必须在早期就被性别分开。集约化养殖要求每窝幼崽在20天断奶, 以防止幼崽在下一窝出生时出现。对于 nonintensive 育种, 幼崽可以留在母亲过去20天的年龄, 往往高达28天的年龄。这可能是非常有益的许多转基因菌株, 因为幼崽可能不像 nonengineered 或野生动物的活力。

雄性和雌性幼崽在断奶时分开。只要有可能, 新断奶的幼崽不应该单独居住。如果一只垃圾只包含一个特定性别的小狗, 那么就应该尝试把这只幼崽与其他性别相同的狗放在一起。可能的住房选择是: 1) 如果不在集约化饲养笼中, 一只母幼崽可能留在母亲身上;2) 一只雌性或雄性幼崽可与其他相同性别的幼崽放在同一年龄的不同垃圾中;3) 如果父母是一夫一妻制的一对, 雌鸟可以从笼子里移除, 让一只雄性小狗与父亲住在一起;4) 一只雄性小狗可能与雌性兄弟姐妹一起居住, 年龄可达5周。幼崽的性别应该被验证一周断奶, 以防止不必要的垃圾从不适当的分离幼崽。

应每日检查断奶小鼠和大鼠, 以确保它们茁壮成长。虽然关于实验室动物的护理和使用指南⁵指出, 必须向动物提供食物以防止粪便和尿液污染, 但新断奶的小鼠应得到少量食物 (每鼠标) 放置在笼地板上的玻璃盘 (培养皿) 中。这将鼓励动物转移到有啮齿动物作为其唯一的食物来源。即使是那些被安置在货架上的动物, 通过自动浇水系统为笼子提供水, 如果老鼠看起来脱水, 也可以将水瓶添加到笼子里。

表1。常用的小鼠污渍和股票。

表2。常用大鼠品系及砧木

每年饲养数百万只小鼠和大鼠用于生物医学研究，许多机构选择在内部进行，以降低成本并增加研究选择。内部育种的优势是，1） 研究人员能够通过选择性育种来纵动物的遗传学 2） 他们可以安排怀孕时间以满足研究需要，以及 3） 他们可以根据需要处理胚胎和新生儿。然而，要建立一个成功的繁殖计划，应该了解啮齿动物的发情周期。此外，他们应该了解不同的交配方案、影响啮齿动物繁殖行为的因素和断奶注意事项......所有这些都将在本视频演示中讨论。

让我们从回顾啮齿动物发情周期开始。雌性大鼠和小鼠都是多发情的，这意味着它们在一年或一个繁殖季节中有多个发情周期。每个周期持续 4-5 天，可分为 4 个阶段：发情期、发情期、发情期和发情期。发情期是排卵期，这意味着如果女性处于发情前期或发情期，她就可以怀孕了。

确定发情周期阶段的一种方法是目视检查。用尾巴和前爪放在笼盖上手动束缚动物，仔细检查阴道口和周围组织的大小。在发情前期，阴道口很宽，其特征是周围组织肿胀，呈粉红色且非常潮湿。通常沿着开口的背侧和腹侧边缘有皱纹或条纹。在发情期间，阴道口周围的肿胀减轻，组织不再那么潮湿和粉红色。在 metestrus 期间，阴道口很小，肿胀可以忽略不计。发情期间，阴道区域周围的组织没有肿胀，开口小或闭合。

另一种确定发情周期阶段的更准确方法是阴道细胞学检查，通过灌洗或拭子收集细胞样本。对于灌洗，将乳胶球放在无菌 200 微升吸头的末端，然后将大约 100 微升无菌双蒸水吸入移液器中。接下来，将鼠标从笼子里拿出来，把她放在铁丝笼顶部，尾巴朝向你。牢牢抓住鼠标的尾巴并抬高鼠标的后躯，使只有前爪抓住盖子。将装满的尖端的末端放在阴道管的开口处，不要穿透孔口。轻轻按下球茎，在阴道口排出大约 25-50 微升的水。液体将自发吸入根管中，无需插入尖端。慢慢释放施加在球头上的压力，液体将抽回吸头。使用相同的尖端、球和液体重复 4-5 次，以在单个样品中获得足够数量的细胞。将液体放在载玻片上，让涂片在室温下完全干燥。干燥后，这些发情弥散片可以储存起来以备后用，或者可以立即使用 Wright-Giemsa 染色剂进行染色，这是一种一步染色剂，不需要固定。将载玻片置于染色剂中 45 至 60 秒。

另一方面，要进行拭子采集，请用生理盐水润湿 2 毫米的棉签涂抹器。将涂抹器的尖端插入被束缚的鼠标的阴道中，轻轻转动并将尖端滚动到阴道壁上。然后小心地取出拭子，并将拭子滚动到载玻片上，将细胞转移到干燥的载玻片上。此过程被认为是有压力的，如果不轻柔地执行、适当的约束并使用正确尺寸的棉签，可能会造成损坏。与灌洗一样，一旦载玻片干燥，就可以用 Wright-Giemsa 染色剂染色。染色后，可以在显微镜下检查载玻片。

如果雌性处于发情前期，则细胞被视为圆形、形状良好、有核的上皮细胞簇，其细胞核染色比细胞质更深。如果她处于发情期，则大多数细胞是没有细胞核的角化鳞状上皮细胞。它们的外观呈棱角状，并且位于密集排列的群集中。如果女性在 metestrus，细胞通常是白细胞，特别是中性粒细胞，存在一些角化鳞状上皮细胞。在发情过程中，存在的细胞通常是白细胞，并出现一些有核上皮细胞。

现在您已经了解了啮齿动物的发情周期，让我们讨论如何设置交配。第一步是确定性别，这是通过比较肛门生殖器距离来完成的。在女性中，肛门和外生殖器之间的距离比男性短。根据研究需要和品系的繁殖效率，交配方案可以是一夫一妻制——即一名雌性与一名雄配或一夫多妻制——即两名或多名雌性与一名雄配。

在时间方面，鉴于啮齿动物的发情周期很短，只有 4-5 天，可以随机设置交配。或者他们可以设置"定时交配"，这涉及在雌性处于最大接受性和生育能力的点时将雌性引入交配笼——即发情前期或发情期。无论哪种情况，交配都应该在一天结束时进行，因为啮齿动物是夜行动物，往往在夜间交配。第二天早上，检查雌性是否有交配栓 - 一种由阴道液和精液组成的白色肿块，交配后持续 12-24 小时。如果交配栓在视觉上不明显，轻轻地将钝探针的尖端插入阴道口。交配栓的存在会阻碍探针在阴道口 0.5 cm 范围内的推进。在随机交配的情况下，交配栓的出现通常需要三天时间。塞子的存在确认交配并不能保证雌性怀孕。

一旦观察到交配栓，应监测女性是否有怀孕迹象，例如体重增加。如果堵塞的女性怀孕了，那么发现栓子的那天是胚胎第 0 天或 E0，第二天被认为是妊娠的第一天，或 E1，依此类推，直到分娩——即分娩——在 19 到 21 天之间。产后约 20-24 小时，雌性大鼠和小鼠都会发情并可以再次受孕。

在集约化繁殖计划中，通常用于因基因突变而繁殖寿命较短的动物，雄性动物与雌性和幼崽一起留在笼子里，以便雌性可以立即怀孕另一窝。该计划可能会给女性带来压力，因为她一直在哺乳和妊娠。相反，非集约化繁殖计划包括在雌性明显怀孕后将其分开，并且在她的窝断奶之前不要将她送回雄性的笼子里，这使得这是一个要求较低的繁殖计划。

影响小鼠和大鼠繁殖性能的因素有很多。让我们回顾一下其中的一些，它们出现得更频繁。雌性饲养员的活力在很大程度上取决于近亲繁殖的水平。近亲繁殖的动物更耐寒、更有活力，因此它们会产生更大、更强壮的窝产。另一个可能影响繁殖性能的因素是攻击性行为。一些常用的菌株，例如 C57BL/6 小鼠，倾向于表现出攻击性，这可能会干扰繁殖。当繁殖具有侵略性的菌株时，应密切观察所有窝产仔猪。来自含有攻击性幼崽的窝中的动物不应用于繁殖。温度、湿度和照明波动会导致繁殖效率降低。繁殖室内的噪音和振动也被证明会造成有害影响。经过基因改造的动物往往耐寒和生育能力较差，一些突变可能导致幼崽在出生前或出生后不久死亡。

现在让我们简要回顾一下如何给这些实验动物的幼崽断奶。开始断奶的时间因育种计划而异。在非集约化繁殖的情况下，幼鱼可在 21-28 日龄断奶。但在集约化繁殖的情况下，每窝的幼崽在第 20 天断奶，以防止下一窝出生时出现年长的幼崽。由于啮齿动物可以在 8 周时开始交配，因此雄性和雌性幼崽在断奶时被分开。只要有可能，新断奶的幼崽不应单独饲养。

如果一窝只包含一只给定性别的幼崽，则应尝试将这只幼崽与另一窝相同性别的幼崽安置在一起。下面的手稿列出了断奶幼犬的可能住房选择。应每天检查断奶小鼠和大鼠，以确保它们茁壮成长。对于食物供应，前 7-10 天应在笼地板上放置少量食物，每只小鼠一粒，并在笼子顶部放置额外的食物。这将鼓励动物过渡到将啮齿动物食物作为它们唯一的食物来源。对于供水，即使动物被饲养在带有自动饮水系统的架子上，也应添加一个瓶子。这是为了防止脱水。

最后，让我们看看科学家如何利用内部育种方法来发挥自己的优势。建立交配最常见的应用之一是培育基因型改变的小鼠。为了研究基因的功能，研究人员通常会破坏其遗传密码。然而，这些动物和人类一样是二倍体，因此有同一基因的两个拷贝。因此，为了完全破坏基因，需要培育出两个拷贝功能失调的动物，换句话说，纯合敲除。一个拷贝功能失调的小鼠称为杂合子或 hets。

设置内部交配的另一个好处是测试产前暴露于测试化合物的影响。例如，这里的研究人员为孕妇提供了含有 E7 到 E13 酒精的流质饮食。然后在 E13 上，他们解剖了怀孕的雌性，获得了胎儿的大脑，并将它们切成薄片。最后，载玻片染色显示，产前酒精暴露增加了神经组织中的细胞死亡。

最后，内部育种还允许研究产后疾病，如产后抑郁症。在这项研究中，科学家们首先在哺乳期将垫料从母体中移走。然后，60 分钟后，将幼崽重新引入母猪。为了给雌性带来压力，在笼子里增加了一种新的雄性入侵者。然后，研究人员观察了母体攻击性，包括攻击和咬伤入侵者雄性，以及不同的母体护理行为，如幼犬梳理和护理。获得的数据显示，压力对产后母亲的攻击性和护理都有显着影响。

您刚刚观看了 JoVE 关于在实验室中育种和断奶小鼠和大鼠的基本原理的视频。您现在应该对啮齿动物的发情周期有了更好的了解，并且还知道如何确定周期阶段以及如何使用它来设置成功的交配方案。我们还回顾了可能影响繁殖行为的因素，并解释了如何以及何时给小鼠和大鼠幼崽断奶。一如既往，感谢您的观看！