诊断性尸检与组织采集

此处描述的所有动物实验操作必须遵循机构动物伦理指南，并经IACUC批准。所有操作须遵守3R原则——替代（Replacement）、减少（Reduction）和优化（Refinement），且必须由经过培训的人员执行。

1. 外部检查

尸体剖检的初始步骤应进行全身外部宏观检查，包括肉眼观察身体是否存在病灶和肿块。应检查被毛是否有脱毛区域。评估牙齿和指甲是否存在过度生长或磨损。应注意口部、鼻孔、眼睛、肛门和生殖器开口处被毛是否有任何染色。应进行胶带检测、皮肤刮片和毛皮检查，以检测体外寄生虫（见下文操作步骤）。

1. 胶带检测
   1. 进行胶带检测所需的设备包括手套、一条透明赛璐玢胶带、一块玻璃显微镜载玻片和剪刀。
   2. 操作胶带时必须始终佩戴手套，因为胶带的粘性会从手指上粘起油脂和皮肤细胞，从而遮蔽检测结果或在评估载玻片时造成混淆。
   3. 剪取一段胶带，其宽度略窄于载玻片的宽度，长度短于载玻片的长度。
   4. 小心地将胶带的粘性面按压在肛门及其周围区域，然后迅速取下。
   5. 使用胶带的另一端，将其按压在肩胛骨之间区域，然后迅速取下。
   6. 将胶带贴附到显微镜载玻片上。
   7. 胶带检测样本现已准备好进行显微镜检查。寄生虫卵在4倍放大下可见，但应进一步在10倍放大下观察以准确鉴定物种。
   8. 必须避免触碰胶带的粘性面。胶带会从戴着手套的手上粘起碎屑，使载玻片的观察变得困难。
2. 皮肤刮片检测
   1. 皮肤刮片检测适用于任何存在脱毛、皮肤病变或表皮抓损的区域。
   2. 进行皮肤刮片检测所需的设备包括一块干净的玻璃显微镜载玻片、矿物油和金属刮匙或手术刀片。
   3. 在显微镜载玻片上滴加数滴矿物油。
   4. 在病变或目标区域边缘将皮肤捏成皱褶。
   5. 在皮肤上涂抹少量矿物油。
   6. 将刮匙或刀片的边缘置于皮肤表面，并逆着毛发生长方向进行刮取。
   7. 持续刮取，直至皮肤出现轻微发红。
   8. 将刮取下来的毛发和组织放入载玻片的油滴中。如有需要，可将材料在油中均匀摊开。
   9. 载玻片现已准备好进行显微镜检查。如需要，可在载玻片的油滴上加盖盖玻片。在4倍和10倍放大下进行观察。
3. 毛皮检查
   1. 毛皮检查是最后进行的外部检查，但实际上是在完成内部检查后才执行。
   2. 在采集完所有内脏器官样本后，将动物放入玻璃或塑料培养皿中。
   3. 将培养皿置于冰箱中冷藏15分钟。
   4. 15分钟后，将培养皿置于解剖显微镜下，检查毛皮上是否存在体外寄生虫。大多数毛囊螨会移至毛发末端，易于观察。

2. 腹腔内部大体检查

1. 皮肤的切除
   1. 在雌性动物中，于骨盆前方稍作切口；在雄性动物中，则于包皮上方做一小切口。
   2. 将皮肤切口向上延伸至下颌。
   3. 使用钝性分离法将皮肤从筋膜和肌肉上松解。
   4. 在后肢前方和前肢后方做横向切口。操作时应小心，避免切断腋区的血管。
   5. 使用钝性分离暴露颈部和胸部区域。应格外小心，避免颈部位的颈静脉和颈动脉破裂。
2. 乳腺
   1. 在雌性动物中，检查乳腺组织是否存在肿块、变色或其他异常。
   2. 哺乳期或妊娠期雌性动物的乳腺组织体积会增大，并可能含有乳汁。
   3. 乳腺组织位于腹侧，从胸骨柄上端延伸至外生殖器开口处，并向两侧延伸，几乎在臀部和肩部背侧相接。
   4. 切除乳腺时，需用拇指镊夹住腺体边缘，采用钝性分离法松解其与皮肤的连接。待腺体完全与皮肤分离后，可用虹膜剪切断任何残留的连接，随后将腺体置于固定液中。
3. 皮下腺体
   1. 包皮腺成对存在，位于雄性大鼠包皮前方，外观较大，呈灰黄色，具有泡沫状外观。
   2. 下颌下唾液腺成对存在，位于下颌骨处，并沿颈部延伸至胸骨柄。其表面有坚韧的包膜，且紧密附着于肌肉。
   3. 摘除这些腺体需采用钝性分离法，在颈部区域操作时应格外小心，以防血管破裂。钝性分离是一种解剖技术，通过分离组织暴露深层结构，而不进行切割。
   4. 进行钝性分离时，应使用剪刀将组织撑开而非剪开。将闭合的剪刀尖端插入组织后打开，沿组织自然层面分开。此过程需要耐心和轻柔操作，因为组织牵拉可能导致邻近器官和血管损伤。
   5. 腺体从下方肌肉完全游离后，将其提起，并切断任何残留的连接。
   6. 腺体需至少做一处切口，以利于固定液渗透。
   7. 评估皮下脂肪的数量和分布情况。肥胖动物可能含有大量脂肪，皮肤触感增厚；脱水动物则皮肤弹性降低，触感变薄。
4. 肌肉
   1. 观察腹部、肋间以及颈部和四肢暴露的肌肉，注意是否存在异常增厚、肿块或变色。
   2. 若需取肌肉组织进行分析，应在取出腹腔器官前先行选取并切除样本，以减少血液污染。
5. 打开体腔
   1. 在暴露的腹肌最尾端处做一小的横向切口。
   2. 将腹肌从器官上抬起，沿linea alba切至剑突。
   3. 从正中线向两侧横向切开腹肌，切口位于两侧后肢上方。
   4. 沿两侧肋骨的弧度切开腹肌。
6. 腹部脂肪
   1. 评估体脂的数量和积聚情况。健康动物在腹腔内具有腹部脂肪垫，并在腹腔背侧有一定量的脂肪沉积。极度消瘦或非常年幼的动物，其肾脏周围脂肪不明显。
   2. 观察体脂的颜色，并记录任何异常。

3. 腹腔器官

1. 肝脏
   1. 正常情况下，肝脏颜色应为深红色，边缘光滑且轮廓清晰。异常肝脏边缘增厚，可能出现缺刻或锯齿状边缘。
   2. 处理肝脏时应格外小心，因其组织脆弱。任何破坏器官完整性的操作都会导致血液渗入体腔，从而遮蔽其他器官。
   3. 轻柔地将肝脏从膈肌处向后翻起，并在肝脏前方切断血管。
   4. 将肝脏翻回膈肌方向，抓住连接所有肝叶中央位置的纤维结节。在切断肝脏与肠道和胃的所有连接后，将其提起并取出。
   5. 将肝脏完整取出后，用吸水纸吸去表面多余的血液。在切为较薄片层以利于固定液渗透前，可将其置于生理盐水浴中或用无菌生理盐水冲洗。
2. 胆囊
   1. 胆囊是一个小型透明囊袋，因胆汁积聚常呈黄色。小鼠具有胆囊，而大鼠则无。
   2. 胆囊位于肝脏最上方两叶之间的中线位置，通常通过一条细小的系膜与膈肌相连，该系膜易被意外撕裂，导致胆囊破裂。
   3. 胆囊可随肝脏一并取出，之后再分离用于检查。
3. 脾脏
   1. 脾脏呈深红色，位于胃的下缘弯曲处，外形规则，表面略呈哑光。
   2. 通常雄性动物的脾脏大于雌性。患有体内寄生虫感染、细菌感染或血液疾病的动物可能出现脾脏肿大。
   3. 脾脏负责从循环中滤除受损红细胞，因此富含血液。摘除时应避免刺破器官。
   4. 摘除时，提起脾脏并切断其与胃之间的连接组织。
4. 肠道
   1. 死后变化发生迅速，包括组织内血液淤积，表现为瘀斑样外观，以及肠道因细菌过度生长产气而膨胀。肠道在从体内取出后需进行全面检查。
5. 胃
   1. 胃位于食管远端，外观呈双色，可区分肌性部与腺性部。
   2. 应通过触感评估胃内是否存在食物。啮齿类动物因代谢率高通常持续进食。若胃为空，应予以记录，因其可能提示疾病状态。
   3. 切勿切开胃，以免内容物污染腹腔内其他器官。
   4. 为将胃从肠道中分离，应在胃前方紧邻处切断食管。若需将胃放入共用固定液容器，可在切断前用缝线结扎食管，防止胃内容物溢出。
6. 小肠
   1. 小肠由三段组成：十二指肠、空肠和回肠。其内不含粪粒。
   2. 十二指肠为较短的一段，从胃远端括约肌延伸至空肠起始部。胆管在十二指肠处进入小肠，胰腺组织也更牢固地附着于此段小肠。
   3. 空肠为小肠的中央部分。
   4. 派尔集合淋巴结（Peyer's Patches）由小块卵圆形淋巴组织构成，在大鼠的空肠和回肠非肠系膜面可见³ 。这些结构属于免疫系统的一部分，对免疫系统疾病的诊断具有辅助作用。
   5. 回肠为小肠的远端部分，也是最长的一段，终止于盲肠。
7. 盲肠
   1. 盲肠呈淡绿色，质地非常柔软。
   2. 位于小肠与大肠交界处。
   3. 盲肠内发生发酵作用，若穿刺该器官，将产生恶臭并导致细菌污染其他器官。
8. 大肠
   1. 大肠起始于盲肠，延续至肛门。因其肠腔内可见粪粒，易于识别。
   2. 安乐死后不应立即出现任何出血或变色区域。
9. 肠系膜
   1. 小肠和大肠通过肠系膜固定于体壁，肠系膜为一膜状结构，内含血管、脂肪和淋巴结。
   2. 在移除肠道前，应检查肠系膜是否存在肿大的淋巴结或异常肿块。
10. 胰腺
    1. 胰腺为弥散性器官，位于胃下方及十二指肠起始褶皱之间，呈浅黄褐色至灰色，由多个边缘不规则的小叶组成。
    2. 通常难以完整取出胰腺。
    3. 若需采集胰腺组织，必须在移除肠道前完成。
    4. 确认为胰腺的组织需小心从周围肠系膜组织中分离。
11. 移除肠道
    1. 肠道以整体方式移除，从胃开始延伸至肛门。
    2. 在肛门前方切断大肠，抬起整个肠道并切断所有膜状连接。随后将肠道从肠系膜上分离，切为若干段并进行固定。
    3. 将肠段放入盛有其他器官的容器时，必须将两端结扎，以防肠内细菌污染其他组织。
    4. 可用精细小剪刀沿肠管纵轴剪开以暴露肠腔，暴露后可对内部进行冲洗。
    5. 某些研究可能要求取出部分肠段进行冲洗而非切割。通过将钝针插入切除组织一端，可注入生理盐水或固定液以冲洗内容物。
12. 肾脏
    1. 肾脏为成对器官，紧贴背部肌肉。右肾位置高于左肾。老年动物的肾脏可能被脂肪沉积包裹，导致难以观察。
    2. 其大小和颜色类似于深色的芸豆，表面应光滑。
    3. 肾脏前方紧邻肾上腺，呈小型淡粉色结节状。
    4. 摘除肾脏时，用镊子分离肾脏，并在肾脏与输尿管之间切断。
    5. 肾脏外层有坚韧的包膜，可剥离以更清晰地观察表面。将一侧肾脏沿长轴纵向切开，另一侧作横切。注意肾脏内若有砂砾样物质，可能提示晶体或矿物质沉积。
13. 雌性生殖系统
    1. 子宫呈Y形结构，子宫体短，左右各有一子宫角。子宫角末端连接输卵管和卵巢。未妊娠雌性动物的子宫角呈淡粉色且细薄；妊娠动物的子宫角颜色更深，且有明显血管沿子宫角走行。随着妊娠进展，子宫角呈现“串珠样”外观。发育中的胚胎在子宫角内形成浅色区域，随着胚胎发育，子宫被拉伸，组织变薄，便于观察。
    2. 卵巢位于肾脏下方，因卵泡处于不同成熟阶段而表面粗糙。囊性卵巢含有充满液体的囊泡，液体颜色可从淡黄色至血性不等。
    3. 摘除卵巢时，需在前方切断动脉连接，在后方切断输卵管。如需要，可将卵巢连同子宫一并取出。
    4. 摘除子宫时，应轻柔抓握子宫，施加牵引力，以便在宫颈下方进行切割。切断后，提起子宫体及子宫角，分离其在体腔内的所有连接。
14. 雄性生殖系统
    1. 精囊为白色、呈羊角状的成对结构，位于尿道膀胱前方，于中线处连接前列腺。其大小不一，有时可达盲肠大小。
    2. 前列腺位于尿道膀胱基底部周围，组织通常呈浅黄褐色。老年动物可能出现增生。老年动物体内脂肪较多，可能影响前列腺的观察。
    3. 睾丸成对，位于阴囊内，表面光滑，可见细微血管。小鼠和大鼠缺乏腹股沟环或括约肌，因此可将睾丸缩入腹腔。为观察睾丸，可抓住下腹部的腹膜脂肪垫并向前牵拉，从而将睾丸从阴囊中拉出以便检查。附睾位于睾丸下缘，向上逐渐变细。输精管连接附睾末端并延伸回前列腺。
    4. 摘除睾丸可通过切断阴囊处的连接及输精管实现。
    5. 摘除前列腺和精囊时，需抓住膀胱基底部向上提起，同时切断前列腺下方的连接组织。

4. 胸腔

1. 肺
   1. 肺通常呈鲜粉红色，质地疏松多孔，表面光滑。然而，使用 CO₂ 实施安乐死可能导致肺出血，从而在肺表面出现深红色斑块，严重时可覆盖整个肺表面。
2. 心脏
   1. 心脏呈深红色，具有四个腔室。心室肌肉发达，触感坚实；心房颜色较深，位于心室上方，肌肉较少，外观松弛。
   2. 心包膜是一层薄而半透明的膜，包裹着心脏。
3. 胸腺
   1. 胸腺位于心脏前方，覆盖在气管上方，质地应光滑。
   2. 在幼龄动物中，胸腺呈浅褐色，具有脂肪样质地。
   3. 老龄动物的胸腺中会有脂肪组织浸润，导致胸腺增大并呈现白色。
4. 气管
   1. 气管从会厌延伸至支气管分叉处，是一段具有软骨环的柔韧管道。
   2. 气管腔内应清晰，无任何液体或泡沫状液体。使用 CO₂ 实施安乐死可能因出血导致肺和气管内积聚液体（浆液性、血性或泡沫状）。
5. 食管
   1. 食管从口腔延伸至胃，是一条非常纤细的管道，位于气管正后方、心脏后方，并穿过膈肌进入胃部。
   2. 食管难以完整取出，因其组织虽具弹性但极易撕裂。最简便的取食管方法是在取出心脏和肺后，将其从气管上小心分离。
6. 胸腔器官的取出
   1. 心脏和肺最便于一起取出。
   2. 将镊子垂直于气管方向夹住气管，位置在胸腺上方，牢固夹持。
   3. 用剪刀在镊子前方垂直于气管方向剪断，切断气管和食管。
   4. 保持对气管的夹持，将气管向尾侧提起，剪断肺与肋骨内壁脊柱面之间的连接组织。
   5. 可能需要剪断食管，以便将心脏和肺完全从胸腔中取出。
   6. 心脏取出后，可用生理盐水灌注以清除残留血液和血凝块，或通过主动脉注入固定液进行灌注固定。
   7. 肺切除后需用固定液充气固定。在气管周围松松结扎一道缝线，将连接注射器（内含所选固定液）的针头插入气管腔内，收紧缝线固定针头，缓慢注入固定液直至肺完全膨胀。拔出针头后立即收紧缝线，防止液体泄漏。
7. 口腔
   1. 舌
      1. 啮齿类动物的舌表面光滑。
      2. 应检查舌表面及舌腹面是否存在病变。
      3. 除口腔癌等特殊研究外，舌通常不进行采集。
      4. 切除舌时，需在口腔两侧颊部切开至颞下颌关节处。
      5. 脱位下颌并翻起上颌骨，以暴露会厌和舌根部。
      6. 用镊子牵拉舌体使其伸展，从舌根后方剪断其下方的附着组织。
      7. 保持牵拉状态下，在舌根部水平剪断，使舌完全脱离口腔。
   2. 牙齿
      1. 大鼠每象限有3颗磨牙和1颗门齿，中间由无牙区（齿隙）隔开。牙齿仅唇面覆盖釉质，舌侧表面为牙本质。
      2. 大鼠牙齿通常呈黄/橙色，此颜色在门齿釉质上尤为明显，是由于含有铁的色素所致。该色素约在出生后21天开始出现，并随年龄增长而加深。
      3. 应检查牙齿是否存在过度生长或咬合不正。

5. 头部

1. 眼睛
   1. 眼睛应大小相等，无分泌物。结膜应光滑。
   2. 去除眼睛时，向后下方按压眼球周围的皮肤，使眼球突出于眼眶。使用尖端弯曲的镊子分离眼球，并剪断固定眼球的附着组织。
2. 耳朵
   1. 观察耳朵以进行个体识别。部分研究人员要求将耳标与器官样本一同保存，以确认动物身份。
   2. 检查耳道是否存在病变、肿块或分泌物。
3. 鼻子
   1. 观察鼻部是否有液体或分泌物。
   2. 鼻孔应对称且通畅。

关键术语与定义
小鼠和大鼠最常用的安乐死方法是过量吸入二氧化碳（CO2）气体。根据美国兽医协会（AVMA）的规定，使用CO2是可接受的，但必须满足能够最小化动物厌恶感和痛苦的条件。动物应保留在其原饲养笼中，然后将整个笼子放入安乐死舱内。以每分钟10%至30%舱体体积的置换速率逐步引入CO2，使动物在因碳酸激活伤害性感受器而产生疼痛之前失去意识。一旦呼吸停止，应继续维持CO2气流一段时间，以确保动物确实死亡。过量吸入性麻醉剂也可用于安乐死，尤其适用于需要使用肺组织的研究项目，因为CO2会对肺组织造成损伤。某些实验还可能需要进行放血（exsanguination），以减少组织中的血液体积。
在尸体剖检过程中，准确记录所有观察结果至关重要。应填写一份记录动物完整信息的表格，包括动物编号、性别、饲养条件、出生日期、死亡日期、研究编号/方案编号以及项目负责人（Principle Investigator）的姓名。当暴露体腔以显露内部器官时，需进行肉眼可见的大体内部检查。任何明显的异常均应予以记录。
动物安乐死后应立即开始尸体剖检和组织采集，因为肠道细菌可能迅速渗漏，干扰某些检测结果。内部器官的检查应从腹腔开始，逐步转向胸腔。在取样任何组织前，必须先对器官进行原位观察。用于组织学检查的器官和组织采集需要对样本进行适当处理。组织学样本的厚度应为0.5–1 cm，以确保固定液能够充分渗透。固定的作用是保存生物组织，防止腐败、自溶和分解；同时终止所有持续进行的生化反应，并可能增强处理后组织的机械强度或稳定性。组织固定的主要目标是保存细胞和组织结构，以便制备出可用于染色的薄切片。除非另有说明，最常用的固定液为10%中性缓冲福尔马林。即用型10%中性缓冲福尔马林可由主要供应商商业化获得。

图1. 雌性大鼠的腹部和胸腔器官。

图 2. 雄性大鼠的腹部和胸腔器官。

本视频将帮助您解答的问题
许多研究项目的最后一步是对实验动物进行解剖。通过对体表和内部结构进行详细观察，并采集组织以供进一步分析，可获得大量科研数据。正确掌握组织取材和保存技术，并使用适当的固定液，对于准确解读研究结果至关重要。