无菌组织采集

此处描述的所有动物实验操作必须遵循机构动物伦理指南，并经动物护理和使用委员会（IACUC）批准。所有操作均须遵守3R原则——替代（Replacement）、减少（Reduction）和优化（Refinement），并由经过培训的人员执行。

1. 准备

1. 常用的材料包括喷瓶中的70%酒精、无菌的20-25号针头、两套无菌器械（虹膜剪刀和持针钳，一套用于皮肤，另一套用于内部组织）、纸巾、无菌外科手套、无菌培养皿、无菌培养基和无菌生理盐水。所有步骤均应使用合适尺寸的器械。本演示中展示的是基本外科器械，但器械的选择应与动物大小及所操作的具体组织相匹配。例如，皮肤可用梅奥剪刀，肌肉和器官则使用梅滕鲍姆剪刀或更小的虹膜剪刀，切勿使用处理器官的同一把剪刀剪断肋骨，否则会使其变钝。操作过程中应注意保持组织完整性并维持无菌条件。
2. 操作前至少应提前15分钟开启生物安全柜的风扇，并用70%酒精对内部进行消毒。
3. 若生物安全柜配备有紫外灭菌灯，可进一步用于工作台面的消毒。
4. 准备生物安全柜时需佩戴清洁手套。设备应按使用顺序从左到右依次放入柜内，以实现单向工作流程，防止污染物品污染洁净物品，从而保护所采集的组织或器官免受动物尸体的意外污染。
5. 将纸巾放入生物安全柜内，并用酒精润湿。
6. 非无菌操作人员负责实施动物安乐死。
7. 无菌操作人员需佩戴两副无菌外科手套。
8. 非无菌操作人员将动物尸体放置于纸巾上，并用70%酒精彻底浸湿整个尸体。

2. 组织收获

1. 使用一套无菌剪刀和镊子，在雄性动物包皮前方或雌性动物骨盆骨前方的皮肤上做一横向切口。避免切透腹壁肌肉。
2. 将拇指置于切口下方，抓住切口的头侧边缘。用另一只手牢固握住后肢和尾巴，同时将皮肤向头部方向拉扯。
3. 皮肤将在后肢上方从身体撕脱，并可翻转套过头部和前肢。此操作可在器官采集过程中有效去除毛发污染物。
4. 再次用70%酒精浸泡尸体，并脱去已不再无菌的外层手套。
5. 使用无菌器械打开腹腔。
   1. 脾脏
      1. 采集脾脏时，将动物体位置于右侧卧位。
      2. 可通过腹壁肌肉观察到脾脏。
      3. 在脾脏正上方用剪刀做一切口。
      4. 轻柔地将脾脏从体腔中牵出。
      5. 切断脾脏与胃及胰腺组织之间所有连接时，应避免刺破或撕裂器官。
   2. 肝脏
      1. 采集其他腹腔器官时，将动物置于仰卧位。
      2. 提起腹壁肌肉并剪除，形成一个正对腹腔的椭圆形开口。
      3. 暴露腹腔后，将肝脏向尾侧翻转，使其远离膈肌。
      4. 小心切断肝脏与膈肌之间的任何膜性连接。
      5. 在肝脏与膈肌之间可见的血管处，做一垂直于脊柱的切口。
      6. 提起肝脏并向膈肌方向翻转，以观察其下方的连接结构。
      7. 较小的肝叶与胃及小肠之间存在薄层膜状连接，需予以破坏。
      8. 用镊子夹住肝脏腹面中央的纤维结节，提起器官以寻找所有连接部位，并将肝脏与下方器官和组织分离。
      9. 注意肝脏质地脆弱，易被刺破而导致出血；因此必须小心操作。
   3. 肾脏
      1. 暴露腹腔后，将肠管推向左侧以观察右肾，或推向右侧以观察左肾。
      2. 摘除肾脏时，用镊子刀片从肾脏下方夹起，将其与身体分离。使用剪刀或手术刀片将肾脏从体内剪下。切口应在镊子下方进行，以避免损伤肾脏。
      3. 肾脏取出后，可修剪掉器官周围的脂肪组织。
   4. 卵巢
      1. 暴露腹腔后，将肠管向前推移以暴露子宫。
      2. 沿左侧和右侧子宫角分别追踪至卵巢。
      3. 卵巢体积较小。在年老动物中，卵巢可能包埋于脂肪组织中。
      4. 将镊子滑入卵巢下方，将其与身体分离，并切断其与脂肪及输卵管的连接。
   5. 睾丸
      1. 打开腹腔后，轻柔夹住腹股沟脂肪垫并向前牵拉。
      2. 此操作可将睾丸从阴囊中拉出。
      3. 睾丸暴露后，切断其与阴囊及输精管的连接，使其完全游离。
      4. 两侧睾丸均需进行此操作。
6. 打开胸腔以取出胸腔器官
   1. 将动物置于仰卧位。若需采集胸腔器官，必须将皮肤充分翻折至头部上方。
   2. 夹住剑突并提起，于肋骨后方的腹肌处做一切口，并沿两侧肋弓下缘延伸切口，以暴露膈肌。
   3. 在两侧肋骨最外侧尽可能远的位置做小切口，刺破膈肌，并将膈肌从肋骨上剪离。
   4. 在剑突处抬起肋骨，以观察胸腔内器官。
   5. 将侧方切口向两侧延伸至胸骨顶端，打开胸腔。
   6. 心脏和肺脏通常最便于整体取出。
      1. 将镊子垂直于气管放置，并牢固夹住气管。
      2. 用剪刀在镊子前方紧邻处垂直于气管做一切口，切断气管和食管。
      3. 保持对气管的夹持不松动，向上并向尾侧提起气管，剪断肺脏与肋骨内面脊柱区域的任何连接。
      4. 必要时可进一步切断食管，以便将心脏和肺脏完全从胸腔中取出。
   7. 仅取心脏
      1. 提起心脏，小心切开心包膜。
      2. 主动脉位于动物左侧心脏的头侧部分。
      3. 用镊子夹住主动脉，在镊子远端做一切口，同时保持对主动脉和心脏的把持。
      4. 在切断前腔静脉及肺动脉和肺静脉时，继续用镊子夹住主动脉。
      5. 通过主动脉将心脏从胸腔中提起取出。
   8. 其他胸腔器官
      1. 为保持器械无菌，器官采集顺序如下：胸腺、淋巴结和食管。
7. 脑组织
   1. 在特殊情况下，需采集脑组织进行无菌培养。
   2. 脑组织应在所有其他器官采集完成后最后进行采集。
   3. 若仅需采集脑组织，则无需剥离全身皮肤，而应在颈背部做一切口，并沿背侧中线从前颈延伸至鼻尖。
   4. 将皮肤向两侧拉开后，用70%酒精浸泡暴露的颅骨，并脱去污染的外层手套。
   5. 使用专用的一套无菌脑组织采集剪刀，在颅底处剪断脊柱。
   6. 将剪刀尖插入枕骨大孔，沿中线剪开颅骨以打开颅腔。
   7. 用剪刀刀片的扁平端将顶骨撬离脑组织。
   8. 使用闭合的钝头镊子小心破坏脑干处的神经连接以及脑下方的视交叉。
   9. 以类似方式，将闭合的镊子沿脑下方向前滑动，破坏嗅球处的连接。
   10. 随后可将脑组织完整落入无菌培养液中。
   11. 采集脑组织时，一只手会被视为非无菌状态：该手需握住从下颌下方翻折出的头皮以固定头部，而另一只手进行颅骨切割和脑组织取出操作。
8. 皮肤
   1. 乳腺组织
      1. 乳腺组织分布于胸骨柄顶端至腹侧生殖器开口区域，并向两侧延伸，几乎在髋部和肩部的背侧表面相接。
      2. 检查乳腺组织是否存在肿块、变色或其他异常。哺乳期或妊娠期雌性动物的乳腺组织体积会增大，并可能含有乳汁。
      3. 切除乳腺时，需用钝头镊夹住腺体边缘，采用钝性分离法松解其与皮肤的连接。待腺体与皮肤完全分离后，可用虹膜剪切断剩余连接。
      4. 用70%酒精浸泡暴露的组织表面，并使用一套新的无菌器械开始组织采集。
      5. 采集后的组织在放入培养液前需用无菌生理盐水冲洗。
   2. 皮下肿瘤
      1. 通常情况下，肿瘤细胞会被反复植入动物体内，随后采集所形成的肿瘤以维持肿瘤细胞系。
      2. 在皮肤完整性被破坏之前，必须完成皮下肿瘤的无菌采集操作。
      3. 若肿瘤已发生磨损或坏死，则所采集的组织质量较差，且可能无法保证无菌。
      4. 将动物体位调整至暴露目标区域。沿肿瘤一侧做皮肤切口。
      5. 小心翻起皮肤以暴露肿瘤。将接触皮肤的器械移至一旁，并用70%酒精浸泡暴露的组织。
      6. 使用新的无菌器械，将肿瘤从其下方连接组织中分离，并切断供应肿瘤的血管。
      7. 随后将肿瘤置于培养液中。

关键术语与定义
必须遵循无菌操作技术，以确保组织的无菌性。组织收获应在已用酒精消毒的超净工作台内进行。所有使用的材料必须经过灭菌处理。执行收获操作的技术人员必须穿戴个人防护装备，包括口罩、头帽、无菌手术服和无菌外科手套。手术服必须覆盖手腕，以防止皮肤细胞脱落至开放的体腔、培养皿或无菌培养基中。为维持操作人员的无菌状态，该操作需由第二名非无菌技术人员协助完成动物的安乐死。
在需要精确组织代谢谱分析的实验中，组织收获方法显著影响数据质量。安乐死方式以及组织采集持续时间均可影响组织完整性。例如，二氧化碳安乐死可诱发缺氧，可能改变组织代谢物水平，并导致肺等器官出血。尽管这种缺氧并不总是严重到妨碍后续应用（如组织培养），但仍可能影响敏感的代谢检测结果。因此，通常更倾向于采用其他安乐死方法。颈椎脱位技术因其作用迅速且降低缺氧相关代谢变化的风险而被广泛使用。此外，使用氧气输送的异氟烷过量也是一种可行选择，可在维持组织完整性的同时最小化缺氧效应。此外，在连续解剖过程中，组织取出的顺序和速度仍至关重要，因为延迟可能导致细胞持续活动和组织降解，从而引起代谢变化。 
虽然大多数无菌收获仅针对单一器官，但有时也可能需要多个器官。在连续解剖过程中，所需组织将决定其取出顺序。易快速降解的组织应在安乐死后尽快获取。为保持器械无菌，腹腔内器官应按以下顺序取出：脾脏、肝脏、肾脏、肾上腺、卵巢或睾丸、附属性腺（前列腺、精囊、子宫、输卵管）、胰腺组织、淋巴结、膀胱以及肠道（胃、小肠和大肠）。胸腔器官的收获顺序为：首先取出心脏和肺，随后采集胸腺、淋巴结和食管。每只小鼠均需更换新手套。
部分无菌收获的器官可能需要保存。组织保存可通过液氮（LN2）速冻，或结合使用液氮与2-甲基丁烷实现。仅使用液氮时，组织需用无菌生理盐水冲洗，再用无菌吸水布吸干多余水分，包裹于无菌铝箔中，立即浸入液氮。  对于免疫学样本，则需添加2-甲基丁烷。将组织实际浸入由液氮冷却的2-甲基丁烷中，待组织变白后，将其从2-甲基丁烷中取出，放入无菌包装袋中，再直接置于液氮中保存。

本视频将帮助您解答的问题
尽管无菌器官采集的许多操作步骤与常规尸体解剖相似，但必须采用无菌技术，以确保所获取的组织可用于实验操作，例如从切除的组织中分离细胞。若未能维持无菌条件，从组织中进行RNA分析或收集RNA的过程可能会受到干扰。