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创建维诺格拉茨基柱：在沉积物样本中丰富微生物物种的方法

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Microbiology

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Creating a Winogradsky Column: A Method to Enrich the Microbial Species in a Sediment Sample

6.2: Serial Dilutions and Plating: Microbial Enumeration

126,459 Views

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08:08 min

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April 30, 2023

Overview

资料来源：伊丽莎白·苏^特1，克里斯托弗·科尔^博1，乔纳森·布莱^泽1
¹大学生物科学系，瓦格纳学院，1 校园路，纽约州斯塔顿岛，10301

维诺格拉茨基柱是一个微型的封闭生态系统，用于丰富沉积物微生物群落，特别是那些参与硫循环的微生物群落。该柱在19世纪80年代首次由谢尔盖·维诺格拉茨基使用，此后应用于生物地球化学中涉及的多种微生物的研究，如光合体、硫氧化剂、硫酸还原剂、甲烷原、铁氧化剂、氮循环器，以及更多（1，2）。

地球上的大多数微生物被认为是不可培养的，这意味着它们不能被隔离在试管或培养皿（3）。这是由于许多因素，包括微生物依赖于其他代谢产物。维诺格拉茨基柱中的条件与微生物的自然栖息地（包括它们与其他生物的相互作用）紧密地模仿，并允许它们在实验室中生长。因此，这项技术允许科学家研究这些生物体，并了解它们对地球生物地球化学循环的重要性，而不必孤立地生长。

地球的环境充满了微生物，它们生长在所有类型的栖息地，如土壤、海水、云层和深海沉积物。在所有栖息地，微生物相互依赖。随着微生物的生长，它消耗特定的基质，包括富含碳的燃料，如糖以及营养物质、维生素和氧气等呼吸气体。当这些重要的资源耗尽时，具有不同代谢需求的不同微生物就会开花并茁壮成长。例如，在维诺格拉茨基柱中，微生物首先消耗添加的有机物质，同时消耗柱底层中的氧气。一旦氧气被消耗，厌氧生物就可以接管并消耗不同的有机物质。随着时间推移，不同微生物群落的连续发展称为继承（4）。微生物继承在维诺格拉茨基柱中很重要，微生物活动会改变沉积物的化学成分，进而影响其他微生物的活性等等。土壤和沉积物中的许多微生物也沿着梯度生活，梯度是两种不同类型的生境之间的过渡区，基于基质的浓度（5）。在梯度的正确点上，微生物可以接收不同基质的最佳量。随着维诺格拉茨基柱的发展，它开始模仿这些自然梯度，特别是在氧气和硫化物中（图1）。

图 1：在维诺格拉茨基柱中发育的_氧（O2）和硫化物（H2S）梯度的表示。

在维诺格拉茨基柱中，池塘或湿地的泥浆和水混合在透明的柱子中，允许孵育，通常是在光线下。在柱中加入额外的基质，为社区提供碳源，通常以纤维素和硫的形式存在。光合器通常开始在沉积物的顶层生长。这些光合微生物主要由蓝藻组成，蓝藻产生氧气，呈绿色或红褐色层（图2，表1）。光合作用产生氧气，而氧气对水的可溶性并不高，而且低于此层（图1）。这将产生氧气梯度，从顶层的高浓度氧气到底层的零氧。含氧层称为有氧层，无氧层称为厌氧层。

在厌氧层中，许多不同的微生物群落可以增殖，这取决于可用的基质的类型和数量、初始微生物的来源和沉积物的孔隙度。在柱的底部，厌氧分解有机物的生物体可以茁壮成长。微生物发酵产生有机酸从纤维素的分解。然后，硫酸盐还原剂可以使用这些有机酸，利用硫酸盐氧化这些有机物，并生产硫化物作为副产品。如果沉积物变黑，硫酸盐还原剂的活性表示，因为铁和硫化物会反应形成黑色硫化铁矿物（图2，表1）。硫化物也会向上扩散，从而产生另一个梯度，其中硫化物浓度高在柱的底部，低在柱的顶部（图1）。

在柱的中间附近，硫氧化剂利用从上面供应的氧气和下面的硫化物。光合硫氧化剂在适当的光量下可以开发在这些层中。这些生物体被称为绿色和紫色硫细菌，通常显示为绿色、紫色或紫红色细丝和斑点（图2，表1）。绿色硫磺细菌对硫化物的耐受性较高，通常发展在紫硫细菌正下方的层中。紫硫细菌以上，紫无硫菌也可能发展。这些有机体使用有机酸作为电子捐赠者而不是硫化物进行光合，通常表现为红色、紫色、橙色或棕色层。非光合硫氧化剂可以发展在紫色非硫细菌之上，这些通常表现为白色细丝（图2，表1）。此外，在维诺格拉茨基列中也可能形成气泡。有氧层中的气泡表示蓝藻产生的氧气。厌氧层中的气泡很可能是由于甲烷原的活性，这种生物体有氧分解有机物，形成甲烷作为副产品。

列中的位置	功能组	有机体示例	视觉指示器
返回页首	光合成器	蓝藻	绿色或红褐色图层。有时是氧气的气泡。
	非光合硫氧化剂	比吉亚托亚，蒂奥巴奇鲁斯	白色图层。
	紫色无硫细菌	罗多微比姆，罗多斯皮里卢姆，罗多普苏德蒙纳斯	红色、紫色、橙色或棕色图层。
	紫色硫磺细菌	铬	紫色或紫色-红色图层。
	绿色硫磺细菌	氯比	绿色图层。
	硫酸盐还原细菌	脱苏尔福维布里奥、脱硫素、脱硫杆菌、脱硫菌	黑色层。
底部	梅萨诺根	美他球菌，美他拉诺沙西纳	有时是甲烷的气泡。

表 1：可能出现在经典维诺格拉茨基柱中，从上到下的主要细菌群。给出了每组生物体的例子，并列出了每一层生物体的可视指标。根据佩里等人（2002年）和罗根等人（2005年）。

Procedure

1. 设置

要设置维诺格拉茨基列，您需要一些基本用品：
- 铲子、水桶和瓶子在现场收集样品
- 垂直透明容器，如约 1L 的分级钢瓶或塑料水瓶
- 塑料包装和橡皮筋
- 大搅拌碗和大勺子搅拌
- 硫源（蛋黄或硫酸钙）
- 有机碳的来源（纤维素，碎纸的形式）
- 光源（阳光窗或台灯）
- 从沼泽、湿地、池塘或溪流中收集的土壤或泥浆
- 来自同一栖息地的水
- 对于本协议中介绍的一些可选实验，需要以下操作：
  - 食盐
  - 不同颜色的玻璃纸
  - 铁的来源（如钉子或钢羊毛）
  - 带光源的冰箱
  - 光源附近的散热器
如果使用塑料水瓶，切断颈部区域，使柱子呈圆柱状。去除所有包装，使光线可以穿透塑料。
生鸡蛋可能含有沙门氏菌，应小心处理。应遵循适当的洗手技术。或者，可以使用煮鸡蛋。此外，无法确定泥浆或沉积物是否受到污水或其他有害物质的污染。混合泥浆和设置柱子时，应使用手套。

2. 组装维诺格拉茨基列

使用铲子，挖出并收集泥浆到桶中。沉积物应靠近水的边缘，并完全饱和与水。您将需要足够的泥浆来填充每个维诺格拉茨基列。从同一水源收集一些水到样品瓶中（每列大约需要 3000 mL）。
在实验室中，将足够的泥浆转移到第一个搅拌碗中，以填充 ±75% 的 1 升容量柱。接下来，筛选以去除大岩石、树枝或树叶，同时使用勺子将团块分开。
搅拌时，将收集的一些水加入搅拌碗中。加入，直到水泥混合物的一致性像奶昔。继续确保没有块状。
将大约 1/3 的水泥奶昔转移到第二个碗中。加入蛋黄和一把切碎的报纸，混合。
将泥浆、蛋黄和报纸的混合物添加到栏中，直到栏满 1/4。
将常规的水泥混合物加入柱中，直到柱满约 3/4。
将额外的水添加到柱子中，只留下一小块空间（约 1/2 英寸）空气。
用塑料包装盖住柱子，用橡皮筋固定。
在室温下在光中孵育柱子。
在接下来的 4 到 8 周内，监视 Winogradsky 列中的变化，以形成不同颜色的层和气泡的形成，如表 1 所述。此外，还应记录不同图层开发所需的时间。

3. 对古典维诺格拉茨基列的可选修改

在加水和搅拌之前，将每 1L Winogradsky 柱中的 25-50 克盐添加到收集的泥浆中（步骤 2.3）。添加盐选择对嗜晕（爱盐）细菌。
备用基板，如铁，以钉子或钢毛的形式，可以添加到柱与蛋黄和切碎的报纸（步骤2.4）。这将丰富铁氧化细菌，如Gallionella，并会出现为锈色层。
而不是室温（步骤2.9），柱可以孵育在散热器附近，以选择热亲（热爱）细菌或冰箱与光源选择亲热（爱冷）细菌。
在高光、低光或暗度下，柱子在孵育时接收的光量（步骤 2.9）也可以变化。
进入光的波长可以通过在孵育时用不同遮光的玻璃纸覆盖柱（步骤 2.9）来确定为不同的细菌组选择的颜色。

4. 数据分析

1-3周后，经典维诺格拉茨基柱的泥层顶部应可见一些绿色（图2A）。这些是蓝藻层生长的最初迹象。
随着时间的推移，继续监测不同层的外观和演变，每个层都指示不同的细菌类型。提示：请参阅概念和表 1 以了解哪些细菌对不同层有贡献。

图 2A：一张经典维诺格拉茨基柱的照片，在室温下孵育了21天。注意柱的上部的绿色沉积物，指示蓝藻。

如果还准备了对经典维诺格拉茨基列的修改，请比较每个列的结果。
1. 观察每个修改后的维诺格拉茨基列中的图层。请注意以下事项：
  - 列的图层数相同吗？
  - 图层的颜色和厚度相同吗？
  - 图层发生在相同的深度吗？
  - 每个列需要多长时间才能发展？
  - 一列的速度比其他列发展得慢吗？

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5. Results

In this experiment, water and sediment were collected from a freshwater habitat. Two Winogradsky columns were constructed and allowed to develop: a classical Winogradsky column incubated in the light at room temperature (Fig. 2A) and a Winogradsky column incubated in the dark at room temperature (Fig. 2B).

Figure 2B: A photo of classical Winogradsky column (left), incubated at room temperature in light for 68 days and a Winogradsky column incubated at room temperature in the dark for 68 days (right).

After allowing the columns to develop for 7-9 weeks, the layers in the classical column can be compared to the column incubated in the dark (Fig. 2B). In the classical Winogradsky column, a green cyanobacterial layer can be observed near the top of the tube. Near the center of the tube, a red-purple layer can be observed, indicative of purple nonsulfur bacteria. Under this layer, a purple-red layer is observed, indicative of purple sulfur bacteria. Directly under this layer, black sediment can be observed in the anaerobic region of the column, indicative of sulfate reducing bacteria.
The column grown in the dark (Fig. 2B) developed differently than the classical Winogradsky column. Like the classical column, the dark column yielded black sediment near the bottom of the column, indicative of sulfate reducing bacteria. The dark column did not yield the green cyanobacterial layer, nor the red, purple, or green layers indicative of purple nonsulfur, purple sulfur, and green sulfur bacteria, respectively. These groups are dependent on light for growth, and therefore unable to grow in the dark.
The precise results of each Winogradsky column will vary widely with their incubation conditions and their source habitats.
1. Microbial communities originating from freshwater habitats will not be accustomed to high salt concentrations and the addition of salt may slow down or inhibit growth. Conversely, there may be sufficient halophilic bacteria in brackish and saltwater habitats so that the addition of salts makes no difference or even enhances the growth of particular layers when compared to a column without added salts.
2. Sandy sediments are more porous than muddy sediments. If enough sulfide is produced in such porous sediments, sulfides can diffuse all the way to the top of the column and inhibit growth of aerobic organisms. In this case, the column may only contain layers indicative of anaerobes and may not contain any aerobes, such as the cyanobacteria.
3. Freshwater generally contains less sulfate than saltwater. Sulfate is important for the growth of sulfate-reducing bacteria. Sulfate reducers create sulfide as a byproduct and are indicated by the development of a black layer in the bottom of the column. If sulfate is not supplemented to freshwater communities, sulfate reducers may not produce enough sulfide. The creation of the sulfide byproduct is important for the growth of green and purple sulfur bacteria and the nonphotosynthetic sulfur oxidizers. In these cases, sulfur oxidizers can still grow using the egg yolk as a source of sulfur, even if the sulfate reducers (black layer) never develop.
4. Different wavelengths of light should select for organisms with different absorption pigments. A column kept in the dark will only allow for nonphotosynthetic organisms to grow, including sulfate reducers, iron oxidizers, and methanogens. Photosynthesizers have pigments that absorb light at different wavelengths within the visible range (~400-700nm). By covering a column with, for example, blue cellophane, blue light (~450-490nm) is blocked from entering the column. All of the photosynthesizers in the column have pigments which require the blue wavelengths (6) and their growth should be inhibited. On the other hand, red cellophane will block light of ~635-700nm. These wavelengths are important for the pigments used by cyanobacteria (6), while purple sulfur, green sulfur, and purple nonsulfur bacteria may still be able to grow.
5. Different microbial communities may have vastly different adaptive abilities to cope with changes in temperatures. High temperatures can enhance rates of microbial activity when sufficient thermophiles are present. On the other hand, in the absence of thermophiles, high temperatures may decrease overall microbial activity. Similarly, low temperatures may decrease overall microbial activity unless the microbial community contains sufficient psychrophiles.

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地球上的大多数微生物不能在实验室中培养，通常是因为它们依赖于其当地社区内的其他微生物。以发明者谢尔盖·维诺格拉茨基命名的维诺格拉茨基柱是一个微型的封闭生态系统，它丰富了沉积物样本中的微生物群落，使科学家能够研究在地球中发挥重要作用的许多微生物。生物地球化学过程，无需单独隔离和培养它们。

通常，来自生态系统（如池塘或沼泽）的泥浆和水是混合的。作为一个可选的实验，盐可以添加到这种混合物中，以丰富各种嗜哈生物物种。其次，一小部分混合物辅以碳，通常以报纸的纤维素和硫的形式补充，通常来自蛋黄。对于另一个可选的实验，指甲可以添加到这种混合物中，以丰富某些Gallionella物种。然后，此新混合物将添加到透明列中，以便该列已满四分之一。最后，将其余的泥浆混合物和更多的水添加到柱中，直到大部分水充满。

继承是指不同微生物群落随时间的连续发展，可以通过维诺格拉茨基柱实时观察。当微生物在柱内生长时，它们会消耗特定的基质并改变其环境的化学成分。当它们的基质耗尽时，原来的微生物就会消失，具有不同代谢需求的微生物可以在改变的环境中茁壮成长。随着时间的推移，明显不同的层开始形成，每个层都含有具有不同微环境需求的细菌群落的一部分。

例如，主要由蓝藻组成的光合微生物在柱顶附近形成绿色或红褐色层。由于光合作用产生氧气，通常被视为柱顶部的气泡，因此形成梯度，顶部附近有最高的氧浓度，底部为最低。根据可用的基质，不同的微生物群落可以在厌氧底层生长。这一层中的气泡可以指示甲烷原的存在，通过发酵产生甲烷气体。在这里，纤维素的微生物发酵产生有机酸。硫酸盐还原剂氧化这些酸产生硫化物，其活性由黑色沉积物指示。硫化物在柱中向上扩散，形成另一个梯度，其中硫化物浓度最高，朝向柱底，最低接近顶部。在柱的中间，硫氧化剂利用上面的氧气和下面的硫化物。光线充足，光合硫氧化剂，如绿色和紫色硫细菌，发展。绿色硫磺细菌可耐受较高的硫化物浓度。因此，它们生长在紫硫细菌的正下方。正上方，紫色无硫细菌形成红橙色层。非光合硫氧化剂由白色细丝的存在表示。

光和温度等条件也可以变化，以丰富其他社区。在本视频中，您将学习如何构建维诺格拉茨基柱，并改变生长条件和基质以丰富特定的微生物群落。

首先，找到适当的水生生态系统，如池塘或沼泽。沉积物样本应来自靠近水缘的区域，并完全饱和水。然后，使用铲子和铲斗收集一至两升饱和泥浆。接下来，从同一来源获取大约三升淡水，然后带着现场样品返回实验室。

在实验室中，穿上适当的个人防护装备，包括实验室外套和手套。现在，将大约 750 毫升的泥浆转移到搅拌碗中。然后，在泥浆中筛选，清除大岩石、树枝或树叶，用勺子将任何块块分开。接下来，将一些淡水加入搅拌碗中，用大勺子搅拌。加水，直到水泥混合物的稠度类似于奶昔。继续确保没有块状。

作为可选的实验，通过在泥浆混合物中加入25至50毫克的盐来选择嗜晕细菌。

然后，将大约 1/3 的水泥混合物转移到第二个搅拌碗中。在碗里加一个蛋黄和一把碎报纸。接下来，将这种混合物添加到列中，直到它达到大约 1/4。接下来，将不含鸡蛋和报纸的水泥混合物添加到柱中，直到大约 3/4 满。然后，向柱子添加更多水，在顶部留出 1/2 英寸的空间。用塑料包装盖住柱子，用橡皮筋固定。

在接下来的四到八周内，在室温下的窗户附近的光线中孵育柱子。在整个潜伏期，每周至少监测一次维诺格拉茨基柱的变化，以形成不同颜色的层和气泡的形成。此外，记录不同图层开发所需的时间。

另一个可以修改的，是孵育在散热器附近的柱，以选择嗜热细菌，或在冰箱中选择亲热细菌。通过在高光、低光或暗度下放置不同的柱子来孵育，从而改变光线条件。或者，通过用不同色调的玻璃纸覆盖柱，以确定哪些颜色为不同的细菌组选择，从而限制进入光的波长。对于另一个可选的实验，为了丰富铁氧化细菌，在添加报纸和蛋黄之前，在泥水混合物中加入钉子。

一到两周后，在经典维诺格拉茨基柱的泥层上，用绿色或红褐色薄膜指示蓝藻层的生长。随着时间的推移，不同层的外观和演化被监测，每个菌株都显示出不同类型的细菌存在。当将在黑暗中生长的柱子与传统的维诺格拉茨基柱进行比较时，我们看到深色处理会产生柱子底部的黑色层，这表明硫酸盐的细菌减少。

暗柱也可能产生其他层，这取决于其他孵育条件。此外，暗柱不会产生绿色蓝藻层，也不会分别产生红色、紫色或绿色层，分别指示紫色无硫、紫色硫和绿色硫细菌。这些群体的增长依赖于光。

Results

在这个实验中，水和沉积物是从淡水栖息地收集的。两个维诺格拉茨基柱被建造并允许开发：一个经典的维诺格拉茨基柱在室温下在光线下孵育（图2A），一个维诺格拉茨基柱在室温下在黑暗中孵育（图2B）。

图 2B：经典维诺格拉茨基柱的照片（左），在室温下在光线下孵育68天，在室温下在黑暗中孵育68天（右）。

允许列发育 7-9 周后，可以将经典列中的图层与在黑暗中孵育的列进行比较（图 2B）。在经典的维诺格拉茨基柱中，在管顶部附近可以看到绿色的蓝藻层。在管中心附近，可以观察到红紫色层，表明紫色无硫细菌。在这一层下，观察到紫红色层，指示紫硫细菌。直接在这一层下，可以在柱的厌氧区域观察到黑色沉积物，指示硫酸盐减少细菌。

在黑暗中生长的柱子（图2B）的发展不同于经典的维诺格拉茨基列。与经典柱一样，暗柱在柱子底部附近产生黑色沉积物，表明硫酸盐减少了细菌。暗柱没有产生绿色蓝藻层，也没有分别代表紫色无硫、紫色硫和绿色硫细菌的红色、紫色或绿色层。这些群体依靠光来生长，因此无法在黑暗中生长。

每个维诺格拉茨基列的精确结果将随着它们的孵化条件和来源生境而有很大差异。

源自淡水生境的微生物群落将不习惯高盐浓度，添加盐可能会减缓或抑制生长。相反，在咸水和咸水栖息地中可能有足够的嗜晕细菌，因此，与没有添加盐的柱相比，添加盐不会有什么区别，甚至能促进特定层的生长。

沙质沉积物比泥沙多孔。如果这些多孔沉积物中产生足够的硫化物，硫化物会扩散到柱的顶部，抑制有氧生物的生长。在这种情况下，该柱可能只包含指示厌食的层，并且可能不包含任何航空，如蓝藻。

淡水的硫酸盐含量通常低于咸水。硫酸盐对减少硫酸盐细菌的生长非常重要。硫酸盐还原剂将硫化物作为副产品，并通过柱底部黑层的发育来指示。如果不补充淡水群落硫酸盐，硫酸盐还原剂可能无法产生足够的硫化物。硫化物副产品的产生对绿色和紫色硫细菌和非光合硫氧化剂的生长具有重要意义。在这些情况下，硫氧化剂仍可以使用蛋黄作为硫的来源进行生长，即使硫酸盐还原剂（黑色层）从未形成。

对于具有不同吸收颜料的生物体，应选择不同波长的光。在黑暗中保存的柱子只允许非光合生物生长，包括硫酸盐还原剂、铁氧化剂和甲烷原。光合成器具有在可见范围内（+400-700nm）内吸收不同波长的光的颜料。通过覆盖一列，例如，蓝色玻璃纸，蓝光（+450-490nm）被阻止进入列。柱中的所有光合形器都有需要蓝色波长（6）的颜料，其生长应受到抑制。另一方面，红色玻璃纸会阻挡+635-700nm的光。这些波长对于蓝藻（6）使用的颜料非常重要，而紫色硫、绿色硫和紫色非硫细菌可能仍然能够生长。

不同的微生物群落在应对温度变化方面可能具有截然不同的适应能力。当有足够的嗜热剂时，高温可以提高微生物活性。另一方面，在没有嗜热剂的情况下，高温可能会降低整体微生物活性。同样，低温可能会降低整体微生物活性，除非微生物群落含有足够的嗜血物。

Applications and Summary

维诺格拉茨基专栏是相互依存的微生物生态系统的一个例子。在垂直柱中混合泥浆、水和额外的碳和硫基板后，分层生态系统应在几周内稳定成单独的稳定区域。这些区域被不同的微生物占据，这些微生物沿着底部富含硫化物的沉积物和顶部富氧沉积物之间的梯度在一个特定点上茁壮成长。通过操纵 Winogradsky 柱内的条件和基质，不同微生物（如嗜烟剂、嗜热剂、嗜血液、硫氧化剂、脱硫剂、铁氧化剂和光合子）的存在和活性可以观察到。

References

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Transcript

Most of the Earth’s microorganisms cannot be cultured in a lab, often because they rely on other microbes within their native communities. A Winogradsky column, named for its inventor Sergei Winogradsky, is a miniature, enclosed ecosystem which enriches the microbial communities within a sediment sample, enabling scientists to study many of the microbes that play a vital role in Earth’s biogeochemical processes, without needing to isolate and culture them individually.

Typically, mud and water from an ecosystem, such as a pond or a marsh, are mixed. As an optional experiment, salt can be added to this mixture to enrich various halophile species. Next, a small portion of the mixture is supplemented with carbon, usually in the form of cellulose from newspaper, and sulfur, usually from an egg yolk. For another optional experiment, a nail can be added to this mixture to enrich certain Gallionella species. This new mixture is then added to a transparent column, so that the column is one quarter full. Finally, the rest of the mud mixture and more water is added to the column until it is most of the way full.

Succession, which refers to the consecutive development of different microbial communities over time, can be observed in real time with a Winogradsky column. As microbes grow within the column, they consume specific substrates and change the chemistry of their environment. When their substrates are depleted, the original microbes die off and microbes with different metabolic needs can flourish in the altered environment. Over time, visibly distinct layers begin to form, each containing parts of a bacterial community with different microenvironmental needs.

For example, photosynthetic microbes, largely composed of cyanobacteria, form green or red-brown layers near the top of the column. Since photosynthesis produces oxygen, often seen as bubbles in the top portion of the column, a gradient is formed with the highest oxygen concentrations near the top, and the lowest towards the bottom. Depending upon the available substrates, different microbial communities can grow in the anaerobic bottom layer. Bubbles in this layer can indicate the presence of methanogens, which create methane gas via fermentation. Here, the microbial fermentation of cellulose results in organic acids. Sulfate reducers oxidize those acids to produce sulfide, and their activity is indicated by black sediment. Sulfide diffuses upward in the column, creating yet another gradient where sulfide concentrations are highest towards the bottom of the column, and lowest near the top. Towards the middle of the column, sulfur oxidizers utilize the oxygen from above and sulfide from below. With adequate light, photosynthetic sulfur oxidizers, such as green and purple sulfur bacteria, develop. Green sulfur bacteria tolerate higher sulfide concentrations. Thus, they grow directly below the purple sulfur bacteria. Directly above this layer, purple non-sulfur bacteria form a red-orange layer. Nonphotosynthetic sulfur oxidizers are indicated by the presence of white filaments.

Conditions such as light and temperature can also be varied to enrich other communities. In this video, you will learn how to construct a Winogradsky column, and vary the growing conditions and substrates to enrich specific microbial communities.

First, locate an appropriate aquatic ecosystem, such as a pond or marsh. The sediment samples should come from the area near the water’s edge, and be completely saturated with water. Then, use a shovel and a bucket to collect one to two liters of the saturated mud. Next, obtain approximately three liters of fresh water from the same source and return to the lab with the field samples.

In the lab, put on the appropriate personal protective equipment, including a lab coat and gloves. Now, transfer approximately 750 milliliters of mud to a mixing bowl. Then, sift through the mud to remove large rocks, twigs, or leaves and use a spoon to break apart any clumps. Next, add some of the fresh water to the mixing bowl, and stir with a large spoon. Add water until the consistency of the water-mud mixture is similar to a milkshake. Continue to make sure there are no clumps.

As an optional experiment, select for halophilic bacteria by adding 25 to 50 milligrams of salt to the mud mixture.

Then, transfer approximately 1/3 of the water-mud mixture to a second mixing bowl. Add one egg yolk and a handful of shredded newspaper to the bowl. Next, add this mixture to the column, until it is about 1/4 full. Next, add the water-mud mixture without the egg and newspaper to the column, until it is approximately 3/4 full. Then, add more water to the column, leaving a 1/2 inch space on top. Cover the column with plastic wrap and secure it with a rubber band.

Incubate the column in the light near a window at room temperature for the next four to eight weeks. Throughout the incubation period, monitor changes in the Winogradsky column at least once a week for the development of different colored layers and the formation of bubbles. Additionally, record the time it takes for different layers to develop.

Another modification that can be done is incubating the column near a radiator to select for thermophilic bacteria, or in a refrigerator to select for psychrophilic bacteria. Vary the light conditions by placing different columns in high light, low light, or darkness to incubate. Alternatively, limit the wavelength of incoming light by covering the column with different shades of cellophane to determine which colors select for different bacterial groups. For another optional experiment, to enrich iron-oxidizing bacteria, add a nail to the mud-water mixture prior to the addition of newspaper and an egg yolk.

After one to two weeks, growth of the cyanobacterial layer is indicated by a green or red-brown film on top of the mud layer of the classical Winogradsky column. Over time, the appearance and evolution of the different layers is monitored, each indicative of the different types of bacteria present. When comparing a column grown in the dark to a traditional Winogradsky column, we see the dark treatment yields the black layer at the bottom of the column, indicative of sulfate-reducing bacteria.

The dark column may also yield other layers, depending on other incubation conditions. Additionally, the dark column doesn’t yield the green cyanobacterial layer, nor the red, purple, or green layers indicative of purple non-sulfur, purple sulfur, and green sulfur bacteria respectively. These groups are dependent on light for growth.

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