6.1: 创建维诺格拉茨基柱:在沉积物样本中丰富微生物物种的方法

1. 设置

1. 要设置维诺格拉茨基列，您需要一些基本用品:
   • 铲子、水桶和瓶子在现场收集样品
   • 垂直透明容器，如约 1L 的分级钢瓶或塑料水瓶
   • 塑料包装和橡皮筋
   • 大搅拌碗和大勺子搅拌
   • 硫源（蛋黄或硫酸钙）
   • 有机碳的来源（纤维素，碎纸的形式）
   • 光源（阳光窗或台灯）
   • 从沼泽、湿地、池塘或溪流中收集的土壤或泥浆
   • 来自同一栖息地的水
   • 对于本协议中介绍的一些可选实验，需要以下操作:
     • 食盐
     • 不同颜色的玻璃纸
     • 铁的来源（如钉子或钢羊毛）
     • 带光源的冰箱
     • 光源附近的散热器
2. 如果使用塑料水瓶，切断颈部区域，使柱子呈圆柱状。去除所有包装，使光线可以穿透塑料。
3. 生鸡蛋可能含有沙门氏菌，应小心处理。应遵循适当的洗手技术。或者，可以使用煮鸡蛋。此外，无法确定泥浆或沉积物是否受到污水或其他有害物质的污染。混合泥浆和设置柱子时，应使用手套。

2. 组装维诺格拉茨基列

1. 使用铲子，挖出并收集泥浆到桶中。沉积物应靠近水的边缘，并完全饱和与水。您将需要足够的泥浆来填充每个维诺格拉茨基列。从同一水源收集一些水到样品瓶中（每列大约需要 3000 mL）。
2. 在实验室中，将足够的泥浆转移到第一个搅拌碗中，以填充 ±75% 的 1 升容量柱。接下来，筛选以去除大岩石、树枝或树叶，同时使用勺子将团块分开。
3. 搅拌时，将收集的一些水加入搅拌碗中。加入，直到水泥混合物的一致性像奶昔。继续确保没有块状。
4. 将大约 1/3 的水泥奶昔转移到第二个碗中。加入蛋黄和一把切碎的报纸，混合。
5. 将泥浆、蛋黄和报纸的混合物添加到栏中，直到栏满 1/4。
6. 将常规的水泥混合物加入柱中，直到柱满约 3/4。
7. 将额外的水添加到柱子中，只留下一小块空间（约 1/2 英寸）空气。
8. 用塑料包装盖住柱子，用橡皮筋固定。
9. 在室温下在光中孵育柱子。
10. 在接下来的 4 到 8 周内，监视 Winogradsky 列中的变化，以形成不同颜色的层和气泡的形成，如表 1 所述。此外，还应记录不同图层开发所需的时间。

3. 对古典维诺格拉茨基列的可选修改

1. 在加水和搅拌之前，将每 1L Winogradsky 柱中的 25-50 克盐添加到收集的泥浆中（步骤 2.3）。添加盐选择对嗜晕（爱盐）细菌。
2. 备用基板，如铁，以钉子或钢毛的形式，可以添加到柱与蛋黄和切碎的报纸（步骤2.4）。这将丰富铁氧化细菌，如Gallionella，并会出现为锈色层。
3. 而不是室温（步骤2.9），柱可以孵育在散热器附近，以选择热亲（热爱）细菌或冰箱与光源选择亲热（爱冷）细菌。
4. 在高光、低光或暗度下，柱子在孵育时接收的光量（步骤 2.9）也可以变化。
5. 进入光的波长可以通过在孵育时用不同遮光的玻璃纸覆盖柱（步骤 2.9）来确定为不同的细菌组选择的颜色。

4. 数据分析

1. 1-3周后，经典维诺格拉茨基柱的泥层顶部应可见一些绿色（图2A）。这些是蓝藻层生长的最初迹象。
2. 随着时间的推移，继续监测不同层的外观和演变，每个层都指示不同的细菌类型。提示:请参阅概念和表 1 以了解哪些细菌对不同层有贡献。

图 2A:一张经典维诺格拉茨基柱的照片，在室温下孵育了21天。注意柱的上部的绿色沉积物，指示蓝藻。

3. 如果还准备了对经典维诺格拉茨基列的修改，请比较每个列的结果。
   1. 观察每个修改后的维诺格拉茨基列中的图层。请注意以下事项:
      • 列的图层数相同吗？
      • 图层的颜色和厚度相同吗？
      • 图层发生在相同的深度吗？
      • 每个列需要多长时间才能发展？
      • 一列的速度比其他列发展得慢吗？

地球上的大多数微生物无法在实验室中培养，通常是因为它们依赖本地群落中的其他微生物。维诺格拉茨基柱以其发明者谢尔盖·维诺格拉茨基 （Sergei Winogradsky） 的名字命名，是一个微型的封闭生态系统，它丰富了沉积物样本中的微生物群落，使科学家能够研究许多在地球生物地球化学过程中起重要作用的微生物，而无需单独分离和培养它们。

通常，来自生态系统（如池塘或沼泽）的泥浆和水是混合的。作为可选实验，可以在该混合物中加入盐以富集各种嗜盐菌物种。接下来，混合物的一小部分补充碳（通常以来自报纸的纤维素形式）和硫磺（通常来自蛋黄的形式）。对于另一个可选的实验，可以在该混合物中添加钉子以富集某些 Gallionella 物种。然后将这种新混合物添加到透明列中，使该列装满四分之一。最后，将剩余的泥浆混合物和更多的水添加到塔中，直到它大部分充满。

演替是指不同微生物群落随时间的连续发展，可以使用 Winogradsky 色谱柱实时观察。随着微生物在色谱柱内生长，它们会消耗特定的底物并改变其环境的化学性质。当它们的底物耗尽时，原始微生物会死亡，具有不同代谢需求的微生物可以在改变的环境中蓬勃发展。随着时间的推移，明显不同的层开始形成，每个层都包含具有不同微环境需求的细菌群落的部分。

例如，主要由蓝藻组成的光合微生物在柱顶部附近形成绿色或红棕色层。由于光合作用产生氧气，通常被视为塔顶部的气泡，因此会形成一个梯度，其中顶部附近氧浓度最高，底部氧浓度最低。根据可用的基质，不同的微生物群落可以在厌氧底层生长。该层中的气泡可以表明存在产甲烷菌，产甲烷菌通过发酵产生甲烷气体。在这里，纤维素的微生物发酵产生有机酸。硫酸盐还原剂将这些酸氧化成硫化物，它们的活性由黑色沉积物表示。硫化物在色谱柱中向上扩散，形成另一个梯度，其中硫化物浓度在色谱柱底部最高，在顶部附近最低。在塔的中间，硫氧化剂利用来自上方的氧气和来自下方的硫化物。在充足的光照下，光合硫氧化剂（如绿色和紫色硫细菌）会发展。绿硫细菌耐受较高的硫化物浓度。因此，它们直接生长在紫硫细菌下方。在该层的正上方，紫色非硫细菌形成红橙色层。非光合硫氧化剂由白色细丝的存在表示。

光线和温度等条件也可以改变，以丰富其他社区。在本视频中，您将学习如何构建 Winogradsky 层析柱，并改变生长条件和基质以丰富特定的微生物群落。

首先，找到合适的水生生态系统，例如池塘或沼泽。沉积物样本应来自靠近水边的区域，并完全被水浸透。然后，用铲子和水桶收集一到两升的饱和泥浆。接下来，从同一来源获取大约 3 升淡水，并将现场样品返回实验室。

在实验室中，穿戴适当的个人防护装备，包括实验服和手套。现在，将大约 750 毫升泥浆转移到搅拌碗中。然后，筛过泥浆以去除大石头、树枝或树叶，并用勺子掰开任何团块。接下来，在搅拌碗中加入一些淡水，然后用大勺子搅拌。加水，直到水泥混合物的稠度与奶昔相似。继续确保没有结块。

作为可选实验，通过在泥混合物中加入 25 至 50 毫克盐来选择嗜盐细菌。

然后，将大约 1/3 的水泥混合物转移到第二个搅拌碗中。在碗中加入一个蛋黄和一把碎报纸。接下来，将这种混合物添加到色谱柱中，直到它大约 1/4 满。接下来，将不含鸡蛋和报纸的水泥混合物加入柱中，直到它大约 3/4 满。然后，向柱子中加入更多的水，在顶部留出 1/2 英寸的空间。用保鲜膜覆盖色谱柱，并用橡皮筋固定。

将色谱柱在室温下在靠近窗户的光线下孵育 4 到 8 周。在整个孵化期间，每周至少监测一次 Winogradsky 柱的变化，以了解不同颜色层的发展和气泡的形成。此外，记录不同层开发所需的时间。

可以进行的另一种修改是将色谱柱放在散热器附近以选择嗜热细菌，或在冰箱中孵育以选择嗜冷细菌。通过在高光、弱光或黑暗中放置不同的色谱柱来改变光照条件进行孵育。或者，通过用不同深浅的玻璃纸覆盖色谱柱来确定为不同的细菌组选择哪些颜色，从而限制入射光的波长。对于另一个可选的实验，为了富集铁氧化细菌，在添加报纸和蛋黄之前，在泥水混合物中加入钉子。

一到两周后，蓝藻层的生长表现为经典 Winogradsky 柱泥层顶部的绿色或红棕色薄膜。随着时间的推移，不同层的外观和进化受到监测，每层都表明存在不同类型的细菌。将黑暗中生长的色谱柱与传统的 Winogradsky 色谱柱进行比较时，我们发现深色处理会在色谱柱底部产生黑色层，表明存在硫酸盐还原细菌。

深色柱也可能产生其他层，具体取决于其他孵育条件。此外，深色色谱柱不会产生绿色蓝藻层，也不会产生分别表示紫色非硫、紫色硫和绿色硫细菌的红色、紫色或绿色层。这些群体依赖光来生长。