What is serial dilution and why is it used in microbiology?

Serial dilution is a systematic reduction of bacterial concentration through successive resuspension in fixed volumes of liquid diluent, typically in multiples of 10 for logarithmic reduction. It enables microbiologists to obtain manageable concentrations of organisms from samples containing unknown, often large numbers of bacteria, making enumeration and isolation feasible.

How does streak plating differ from spread plating?

Streak plating introduces a diluted sample to solid medium in a zig-zag pattern across thirds of the plate, progressively thinning the sample to isolate individual colonies and observe colony morphology. Spread plating distributes an aliquot evenly across the entire plate surface for quantitative enumeration rather than isolation.

What colony counts are considered valid for CFU calculation?

Plates with fewer than 30 colonies are discarded as too few to count due to greater statistical error. Plates with more than 300 colonies are discarded as too numerous to count because crowding and overlapping lead to underestimation. Valid counts fall between 30 and 300 colonies.

How do you calculate colony forming units per milliliter?

Average the colony count from three plates spread with the same sample and dilution factor. Multiply the average by the dilution factor and divide by the volume plated. This yields CFU/mL, which can be used to generate growth curves using colony forming units and optical density measurements for further analysis.

Why are Winogradsky Column samples suitable for serial dilution and plating?

Winogradsky Column samples contain mixed populations with multiple bacterial species and strains at unknown concentrations. Serial dilution and plating techniques allow researchers to isolate individual colonies, observe different morphologies, and quantify the diverse microbial communities present in aerobic and anaerobic zones.

What information can colony morphology reveal about bacterial populations?

Colony morphology—including shape, size, texture, and color—helps differentiate between bacterial species and strains. A homologous population of a single organism produces uniform colonies, while a mixed population displays colonies with varied characteristics, indicating the presence of different bacterial species or strains in the sample.

What is the significance of using 0.45% saline as a diluent in serial dilution?

Saline blanks serve as the standardized liquid diluent for successive resuspension steps in serial dilution. The 0.45% saline composition maintains osmotic balance and provides a consistent medium for diluting bacterial samples while preserving cell viability and enabling accurate enumeration and isolation of microorganisms.

连续稀释和电镀:微生物枚举

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1. 设置

列出所有材料、逐步实验协议和丢弃耗材方法的流程图应写在实验室笔记本上，并保存在实验工作区附近。
工作空间应使用适当的防腐剂（70%乙醇）进行消毒，实验者应穿着清洁的实验室服装，防止接触异常，从而减轻污染风险。合适的服装包括但不限于实验室外套、乳胶或尼特手套、谷歌、呼吸器和合闭鞋。始终保持无菌技术至关重要。
准备 90 mL 0.45% 盐水。使用清洁的分级钢瓶，测量90 mL的无菌水，并将其转移到一个干净的Erlenmeyer烧瓶标记0.45%盐水。重量为 0.405 g 氯化钠（西格玛-阿尔德里希 NaCl S9888），并将其添加到标有 0.45% 盐水的烧瓶中。反复旋转，直到没有溶质可见。
完成后，实验者应重新消毒所有表面，并丢弃任何不需要的生物体、稀释剂、培养皿或一次性接种回路。"在洗手前，可以去除实验室服装。

2. 媒体准备

选择适合培养所需有机体的介质。在大多数情况下，肉汤可以促进足够的细菌生长。由于这里需要来自维诺格拉茨基协议的生物体，因此组装了由碳酸钙、硫磺、纤维素和泥浆组成的柱，并不受干扰7天。前名列分为有氧、微嗜和厌氧部分。
选择适合电镀感兴趣的有机体的介质。用微生物级琼脂补充液体介质通常用作凝固剂。从前称柱的有氧、微嗜热和厌氧区域采集样品时，LB 培养基/琼脂足够。注:未为这一程序采集来自微亲子区的样品。然而，这些生物应该在蜡烛罐中培养。在密封前将蜡烛引入这个培养室，可营造适合微亲亲菌扩散的低氧环境。
由于我们希望准备 250 mL，请使用 500 mL（或更大）Erlenmeyer 烧瓶，以防止高压灭菌时沸腾。标记一个"Broth"，另一个标记"Agar"。
按照制造商浓度建议确定创建每个解决方案所需的介质量。LB Agar，这里使用，是结合25克/升与超纯水。我们的体积为 250 mL，需要 6.25 LB Agar/250 mL 水的解决方案。同样，LB Broth 是通过将 LB Broth 和水的相同比例组合而成的。因为它没有补充凝固剂，在冷却时不会变硬。
称量介质，并将其与水混合，其比例符合制造商的建议。在标有"Agar"的烧瓶中加入 6.25 克 LB Agar，在标有"Broth"的烧瓶中加入 6.25 克 LB Broth。在每个烧瓶中加入250 mL超纯水。
将铝箔包裹在每个烧瓶上，并使用高压灭菌器在 121°C、15 psi 下对介质进行至少 15 分钟的消毒。
使用耐热手套或垫，在循环完成后从高压釜中取出烧瓶，并将其放入 40-50°C 水浴中。
达到适当温度后，将标有"Broth"的烧瓶内的物品倒入 250 mL Erlenmeyer 或圆底烧瓶中。标注 250 mL 烧瓶"溶液_0"。
获取 10，100mm x 15 mm 无菌培养皿，并标记它们的日期、名称、使用的介质类型和生物体的 Winogradsky 柱区。
从水浴中取出标有"Agar"的烧瓶，开始倒入 10 个培养皿中。每道菜的加餐不应超过15 mL。这也可以使用移液器和 25 mL 血清移液器执行，以提高精度。使用无菌移液器尖端去除任何气泡，然后用板盖盖住，留过夜凝固。

3. 稀释剂制备

准备 10 个能够储存在机架中的 20 mL 或更多的试管，并贴上 T1-T10 标签。每个管号与其对应的稀释系数一致（即 T4 = 1x10^-4或 0.0001 或 1/10，000 的库存浓度）。
将 9 mL 的 0.45% 盐水放入 10 个试管中。
盐碱坯现在已准备好用高压灭菌器消毒。使用铝箔覆盖 10 个试管中的每一个，然后将它们转移到与高压灭菌器兼容的试管机架上。在 121°C、15 psi 下至少消毒 15 分钟。
使用耐热手套取下毛坯，然后冷却。盖上盖子，在4°C下存放，直到需要当管达到室温时，或当冷却到触摸。

4. 培育目标有机体

用先前条纹的板或冷冻股票的50 μL的单一菌群接种"_溶液0"。通过在37°C的孵化器中放置接种的"_溶液0"，让目标生物体有时间进行复制（如有必要）。（注意:应盖住烧瓶以防止污染。如果目标生物体有氧运动，请使用无菌纱布和棉塞来防止污染。如果评估维诺格拉茨基柱的区域，只需从每个所需区域中取出 1 克（本研究目的为有氧和无氧），并在 T1 中重新悬浮，然后再继续步骤 5.3。

5. 串行稀释

从培养箱中获取标有"营养汤"的烧瓶，然后剧烈摇动。
管液1 mL的"_溶液0"进入标有T1的试管。漩涡T1。如果评估维诺格拉茨基的外植，称体重1克的所需区域，并在涡旋前将其添加到T1。（注意:这里使用 1 mL 是为了简单起见 - 也可以使用较小或更大的稀释剂。
从试管 T1 中取出 1 mL 并将其添加到试管 T2 中。漩涡T2。
从试管 T2 中取出 1 mL 并将其添加到试管 T3 中。漩涡T3。
从试管 T3 中取出 1 mL 并将其添加到试管 T4 中。漩涡T4。
从试管 T4 中取出 1 mL 并将其添加到试管 T5 中。漩涡T5。
从试管 T5 中取出 1 mL 并将其添加到试管 T6 中。漩涡T6。
从试管 T6 中取出 1 mL 并将其添加到试管 T7 中。漩涡T7。
从试管 T7 中取出 1 mL 并将其添加到试管 T8 中。漩涡T8。
从试管 T8 中取出 1 mL 并将其添加到试管 T9 中。漩涡T9。
从试管 T9 中取出 1 mL 并将其添加到试管 T10 中。

6. 铺板

将T1稀释的样品直接移至培养皿中。此步骤可以，但不需要，重复为每个管。
获得无菌的一次性扩散杆或火焰消毒玻璃扩散棒。在顺时针/逆时针运动中，滑动摊杆的水平部分，将样品均匀地分布在培养皿中。
对要评估的维诺格拉茨基列的每个区域重复上述步骤。
在37°C培养箱中孵育板24小时。对于厌氧生物，请使用厌氧室。

7. 条纹

选择目标生物体的适当稀释。例如，_溶液4将产生初始浓度的1/10，000稀释。通常，对 1/1，000^th （T3/解决方案）、1/1，000，000^th （T6/溶液_6）和 1/1，000，000（T9/溶液_9）的稀释被评估为列举微生物。
使用塑料无菌一次性接种回路或受火时间不少于 10 秒的可重复使用的金属接种回路，从步骤 5 浸入所需的溶液中。校准的接种回路应传输 0.01 mL。（注意:从热中取出后，不要让火焰循环立即接触细菌）
稍微提高一侧的培养皿盖，以便只有接种回路才能进入琼脂。以锯齿形的方式将接种回路滑过介质顶部，小心不要损害琼脂。放下培养皿盖。
使用新的一次性接种回路或重新消毒可重复使用的回路。
将板旋转大约 1/3^rd （±118°），并降低锯齿形运动的频率。
同样，使用新的一次性循环或在旋转最后一次之前对金属回路进行重新消毒，并再次降低锯齿形频率。放下培养皿盖。
重复步骤7.2 - 7.6，直到至少三个培养皿被条纹三个不同的稀释，使用一个新的一次性循环或重新燃烧一个可重复使用的循环（图2）。
将带条纹的培养皿放在 37°C 培养箱中过夜。对于厌氧生物，使用厌氧室。

8. 数据分析和结果

文化是从7天维诺格拉茨基柱的氧和缺氧区收获的。这些区域分别适用于异营养化和铁氧化性厌氧。
在LB Agar板条纹或扩散之前，柱外植物被连续稀释。
条纹揭示了来自每个被评估的维诺格拉茨基区的混合种群。铺板也产生了类似的结果。
要计算 CFU/mL 或 CFU/g，从三个板中平均计数菌落数。将平均菌落数乘以稀释系数，再除以数量。例如，如果在接种溶液6（T6）0.1 mL的板上平均计算65个菌落，则前面描述的公式等于650，000，000 CFU/mL。
现在可以从每个板块中选择孤立的菌落，用于浓缩测定，以确定物种特性。