连续稀释与涂布：微生物计数

1. 准备工作

1. 应在实验记录本中编写一份流程图，列出所有材料、逐步实验步骤以及废弃物品的处理方法，并将记录本放置在实验工作区附近。
2. 工作台面应使用适当的消毒剂（70%乙醇）进行消毒，实验人员应穿戴洁净的实验服以降低污染风险，同时保护自身免受异常暴露危害。合适的防护装备包括但不限于实验服、乳胶或丁腈手套、护目镜、呼吸器和封闭式鞋子。全程必须严格保持无菌操作技术。
3. 配制90 mL 0.45%生理盐水。使用洁净的量筒量取90 mL无菌水，转移至已标记为0.45%生理盐水的洁净锥形瓶中。称取0.405 g氯化钠（Sigma-Aldrich NaCl S9888），加入标记为0.45%生理盐水的锥形瓶中。反复旋转摇动，直至无可见溶质残留。
4. 实验结束后，实验人员应重新对所有表面进行消毒，并根据OSHA指南丢弃任何不需要的微生物、稀释液原液、培养皿或一次性接种环。在洗手前可脱去实验防护服。

2. 培养基制备

1. 选择适合目标生物培养的培养基。在大多数情况下，液体培养基足以支持细菌生长。由于本实验旨在获取 Winogradsky 培养柱中的微生物，因此构建了一个包含碳酸钙、硫、纤维素和泥浆的培养柱，并静置 7 天。该培养柱可分为好氧、微好氧和厌氧区域。
2. 选择适合目标微生物涂布培养的培养基。通常通过向液体培养基中添加微生物级琼脂作为凝固剂。从上述培养柱的好氧、微好氧和厌氧区域取样时，LB 培养基/琼脂已足够适用。注意：本实验未采集微好氧区域的样品。然而，若需培养此类微生物，应使用烛缸法。在密封培养容器前引入一支燃烧的蜡烛，可形成低氧环境，适合微好氧菌的增殖。
3. 由于我们需要制备 250 mL 培养基，应使用 500 mL 或更大容量的锥形瓶，以防止灭菌过程中发生沸腾溢出。将其中一个标记为 "Broth"，另一个标记为 "Agar"。
4. 根据生产商推荐的浓度确定每种溶液所需的培养基用量。此处使用的 LB 琼脂按 25 g/L 与超纯水混合配制。我们所需体积为 250 mL，因此需配制 6.25 g LB 琼脂 / 250 mL 水的溶液。同理，LB 肉汤也按相同比例混合 LB 肉汤与水配制。由于未添加凝固剂，冷却后不会凝固。
5. 按照生产商推荐的比例称量培养基并将其与水混合。将 6.25 g LB 琼脂加入标记为 "Agar" 的锥形瓶中，将 6.25 g LB 肉汤加入标记为 "Broth" 的锥形瓶中。向每个锥形瓶中加入 250 mL 超纯水。
6. 用铝箔封住每个锥形瓶口，并在 121°C、15 psi 条件下使用高压灭菌锅对培养基灭菌至少 15 分钟。
7. 灭菌程序完成后，使用耐热手套或垫子将锥形瓶从灭菌锅中取出，并置于 40–50°C 水浴中。
8. 当温度降至适宜范围后，将标记为 "Broth" 的锥形瓶中的内容物倒入一个 250 mL 锥形瓶或圆底烧瓶中。将该 250 mL 烧瓶标记为 "solution₀"。
9. 准备 10 个无菌的 100 mm × 15 mm 培养皿，并在上面标注日期、姓名、所用培养基类型以及将要取样的 Winogradsky 培养柱区域。
10. 将标记为 "Agar" 的锥形瓶从水浴中取出，开始向 10 个培养皿中倾注琼脂。每个培养皿中加入的琼脂量不应超过 15 mL。也可使用移液器配合 25 mL 血清移液管以提高准确性。用无菌移液枪头去除存在的气泡，盖上培养皿盖，静置过夜使其凝固。

3. 稀释液的配制

1. 准备10支可容纳20 mL或更大体积的试管，置于试管架中，并标记为T1-T10。每支试管的编号与其对应的稀释倍数一致（例如，T4 = 1×10^-4 或 0.0001 或原液浓度的1/10,000）。
2. 用移液器向10支试管中各加入9 mL的0.45%生理盐水。
3. 生理盐水空白管现已准备好通过高压灭菌器进行灭菌。用铝箔覆盖每支试管，然后将其转移至可耐受高压灭菌的试管架中。在121°C、15 psi条件下至少灭菌15分钟。
4. 使用耐热手套取出灭菌后的空白管，待其冷却。当试管冷却至室温或触感不热时，盖上盖子并储存于4°C，待需要时使用。

4. 目标生物体的培养

1. 从先前划线的平板上挑取单菌落，或取50 µL冻存菌种，接种至"solution₀"中。将接种后的"solution₀"置于37°C摇床中过夜培养（如需要可进行振荡），以使目标生物有足够时间增殖。（注意：应覆盖容器以防止污染。若目标生物为需氧菌，应使用无菌纱布和棉塞防止污染。若需分析Winogradsky柱中的不同区域，可直接从每个目标区域（本研究中包括需氧区和厌氧区）取1克样品，并将其重悬于T1中，随后进行步骤5.3。）

5. 连续稀释

1. 从培养箱中取出标有"Nutrient broth"的烧瓶，并剧烈振荡。
2. 用移液器将1 mL "solution₀"加入标记为T1的试管中。涡旋振荡T1。若需评估Winogradsky微宇宙样品，先称取目标区域1克并加入T1，再进行涡旋振荡。（注意：此处使用1 mL仅为简化操作，也可使用更小或更大的稀释液体积）。
3. 从试管T1中取出1 mL液体，加入试管T2中。涡旋振荡T2。
4. 从试管T2中取出1 mL液体，加入试管T3中。涡旋振荡T3。
5. 从试管T3中取出1 mL液体，加入试管T4中。涡旋振荡T4。
6. 从试管T4中取出1 mL液体，加入试管T5中。涡旋振荡T5。
7. 从试管T5中取出1 mL液体，加入试管T6中。涡旋振荡T6。
8. 从试管T6中取出1 mL液体，加入试管T7中。涡旋振荡T7。
9. 从试管T7中取出1 mL液体，加入试管T8中。涡旋振荡T8。
10. 从试管T8中取出1 mL液体，加入试管T9中。涡旋振荡T9。
11. 从试管T9中取出1 mL液体，加入试管T10中。

6. 涂布平板法

1. 从T1中吸取100 µL稀释后的样品，直接滴加到培养皿中。此步骤可根据需要对每个试管重复操作，但非必需。
2. 取一支无菌的一次性涂布棒，或对玻璃涂布棒进行火焰灭菌。以顺时针/逆时针方向移动涂布棒的水平部分，使样品在培养皿内均匀分布。
3. 对需要评估的Winogradsky柱的每个区域重复上述操作。
4. 将培养皿置于37°C培养箱中培养24小时。对于厌氧微生物，应使用厌氧培养箱。

7. 划线接种

1. 选择目标生物体的合适稀释度。例如，溶液₄ 将得到初始浓度的1/10,000稀释度。通常，1/1,000的稀释度^th (T3/溶液)，1/1,000,000^th (T6/溶液₆) 和 1/1,000,000,000^th (T9/溶液₉用于计数微生物。
2. 使用一次性无菌塑料接种环，或已用火焰灼烧不少于10秒的可重复使用金属接种环，浸入第5步所需的溶液中。校准后的接种环应转移0.01 mL液体。（注意：灼烧后的接种环从热源取出后，不得立即接触细菌）
3. 将培养皿盖子的一侧略微抬起，仅使接种环能够进入琼脂表面。小心地以锯齿状方式将接种环在培养基表面滑动，注意不要划破琼脂。随后盖好培养皿盖子。
4. 使用新的一次性接种环，或对可重复使用的接种环重新灭菌。
5. 将培养板旋转约1/3圈^rd （约118°），并降低之字形运动的频率。
6. 再次使用新的一次性接种环，或在最后一次旋转前重新灭菌金属接种环，并进一步减少之字形划线频率。降低培养皿盖。
7. 重复步骤 7.2 至 7.6，直至完成三个不同稀释度的划线，每个稀释度至少使用三个培养皿，每次使用新的一次性接种环，或重新灼烧可重复使用的接种环（图2).
8. 将划线的培养皿置于37°C培养箱中过夜培养。对于厌氧微生物，应使用厌氧培养箱。

8. 数据分析与结果

1. 从培养7天的温克尔曼柱（Winogradsky column）的有氧区和无氧区分别采集菌群样品。这两个区域分别适合异养菌和厌氧铁氧化菌的生长。
2. 将柱体组织块在接种前进行系列稀释，随后划线或涂布于LB琼脂平板上。
3. 划线结果显示，所检测的每个温克尔曼柱区域均含有混合菌群。涂布平板的结果与此相似。
4. 为计算CFU/mL或CFU/g，需取三个平板上菌落数的平均值，将该平均值乘以稀释倍数，再除以接种体积。例如，若在接种了0.1 mL溶液₆（T6）的平板上平均计数到65个菌落，则按前述公式计算可得650,000,000 CFU/mL。
5. 现在可从每个平板上挑选分离的单菌落，用于富集实验，以确定其物种身份。