6.3: 富集培养:在选择性和微分介质上培养有氧和厌氧微生物

1. 准备

1. 出发前，请彻底洗手，戴上适当尺寸的手套。
2. 用5%的次氯酸钠（漂白剂）对工作面进行消毒，并彻底干燥。
3. 将接种回路放入空的 120 mL Erlenmeyer 烧瓶中，使其在工作时不会接触工作台面。

2. 成长媒体和文化

1. 从冰箱中收集四盘曼尼托盐Agar（MSA）、Eosin亚甲蓝琼脂（EMB）和8个试胶大豆琼脂（TSA）（这些可以商业购买）。
2. 将板放在清洁的工作区域。
3. 收集以下肉汤培养物:大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、金黄色葡萄球菌表皮炎和蛋白石。注意:由于这些是有氧生物，管盖应稍微松弛。
4. 将所有培养物放在清洁工作表面上的试管机架中。

3. 传播文化和孵化

1. 站在或坐在长凳上，所有材料都触手可及。
2. 要使用无菌技术将细菌转移到板中，首先点燃循环，直到它呈橙色发光 - 然后让它在空气中冷却。
3. 当循环冷却时，取大肠杆菌的肉汤培养，然后用小指打开盖子。
4. 迅速点燃管子的开口。这样可以防止污染。
5. 将环浸入管中，将有机体条纹到 EMB 板的第一个象限上。
6. 执行第一个条纹后，火焰循环，然后执行第二个条纹跨越第一个条纹只有一两次。这将允许单一殖民地隔离，并确定是否有任何污染。
7. 重复此操作，直到板的所有四个象限都条纹。
8. 现在，以相同的条纹电镀方式转移其余四个生物体，使最终产品为每个生物体提供一个 MSA 板、一个 EMB 板和两个单独的 TSA 板。
9. 一旦所有生物体被转移，最后一次点燃环，然后把它收起来。
10. 将1个TSA板与每个有机体放入气体包中，然后摇动一个气囊，然后放在板旁的腔室中。密封紧密。
11. 在37°C下孵育所有板过夜。
12. 最后一次用5%漂白剂对工作面进行消毒。

4. 阅读和录制结果

1. 从培养箱中取出板，并将其放在干净的实验室工作台上
2. 记下实验室笔记本中每个盘子上生物体的生长情况。特别是，请详细记录:
   1. 每个板上每个板的菌落数量和大小（如果存在）
   2. 生长在MSA板上的任何菌落周围的琼脂的外观
   3. 在EMB板块上生长的任何殖民地的外观
   4. 与气体封装内部相比，TSA 板块的生长差异

细菌几乎能够栖息在地球上的所有环境中，从沙漠苔原到热带雨林。这种在截然不同的生态位中定植的能力是由于它们的适应性和巨大的代谢多样性，这使它们能够利用多种分子来产生能量。正是这种巨大的多样性导致了地球上只有不到 1% 的细菌物种被认为是可培养的现象，而这些只有在了解它们特定的代谢和环境需求的情况下才有可能。

在实验室中对培养基和环境进行作，不仅可以让研究人员通过实验找到培养目标物种的最佳条件，还可以进行富集，即改变条件以从混合培养物中选择特定物种的过程。一些微生物物种是多面手，能够耐受各种状态或环境。这种生物体在实验室条件下可能很容易生长，但如果给予极端的栖息地，它们也可能被阻止生长——如果目标是丰富来自混合培养物的对这种条件有耐受性的生物体，这会有所帮助。

挑剔的生物体可以培养，但前提是满足特定条件。例如，奈瑟菌或嗜血杆菌物种需要含有部分分解的红细胞和高二氧化碳浓度的培养基，这也可能会阻碍其他物种的生长。极端微生物因其对极端条件的偏好而得名，例如极低或高温、还原或缺氧条件，或存在高盐的情况。大多数其他微生物可能无法忍受这些情况。

为了进一步富集感兴趣的生物体，一些培养基类型包含指标，这些指标可以深入了解生物体的代谢情况。甘露醇盐琼脂抑制对高盐敏感的生物体的生长。革兰氏阴性菌通常无法存活，但革兰氏阳性葡萄球菌属能够茁壮成长。此外，MSA 琼脂表示任何能够发酵甘露醇的菌落，因为发酵的酸副产物会将培养基中的甲基红指示剂变成亮黄色。这可以允许对物种进行更具体的选择。

另一种常见的富集培养基 Eosin Methylene Blue 含有伊红和亚甲蓝染料，它们对革兰氏阳性菌有毒。它还在这些板上含有乳糖和细菌，这些细菌可以发酵，从而产生酸，从而降低 pH 值，促进染料吸收。这些菌落吸收大量色素，呈现深色和金属色。在这个实验室中，您将在三种不同的培养基条件下培养四种不同的测试生物体，然后在好氧与厌氧条件下培养，然后观察它们的发育。

在开始实验之前，请彻底洗手并擦干双手，然后再戴上合适尺寸的实验室手套。然后，用 5% 的漂白剂对工作台面进行消毒，彻底擦拭。接下来，取无菌接种环并将其手柄放入 125 毫升空烧瓶中，使其不接触工作台表面。然后，从冰箱中取出四盘甘露醇盐琼脂 （MSA）、四盘伊红亚甲蓝琼脂 EMB 和八盘胰蛋白酶大豆琼脂 （TSA）。TSA 培养基是一种非选择性生长培养基，将用于两种不同的环境条件。最后，将您感兴趣的培养物收集在管架中。在这里，将生长大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌和普通变形杆菌。

首先，点燃一个本生灯，它将用于对工具进行消毒。然后，将一个 MSA 板、一个 EMB 板和两个 TSA 板放在手边。然后，选择一种细菌培养物。您将用第一次培养物接种所有这四个板。用另一只手拿起接种环，然后在燃烧器的火焰中消毒，直到它发出橙色光几秒钟。让 loop 在空气中冷却。然后，打开肉汤培养管并快速点燃开口。将环浸入培养物中，然后将生物体划线到第一个板的第一个象限上。然后再次对环进行火焰消毒并在第二象限划线。重复这个火焰灭菌然后划线的动作，完成第三象限和第四象限。以这种方式划线应产生孤立的菌落，并且还可以确认培养物未被污染。

现在，盖上盖子，并在板底部贴上细菌名称、培养基类型、日期和您的姓名首字母。然后，对其余三个板中的每一个使用相同的细菌培养物重复条纹电镀，每次都注意标记它们。现在第一次培养物已经划线，对其他细菌重复这些步骤，以获得每个物种的一个接种的 MSA 板、一个 EMB 板和两个 TSA 板。转移完所有生物后，最后一次点燃 Loop。

要确定哪些生物体可以在低氧环境中生长，请打开密封的气室系统，并在其中放置一组四个 TSA 细菌板。然后，将厌氧条件小袋放入腔室中并密封。最后，将所有板（包括密封气室系统内的板）放入 37 摄氏度的培养箱中过夜。今后，每 24 到 48 小时检查一次平板，让菌落有时间生长和代谢任何指示反应物。

为了评估不同细菌种类对每种生长条件的反应如何，首先检查平板的生长情况，并记录哪些物种能够在每种培养基类型以及厌氧与需氧条件下产生菌落。注意生长的生物体的颜色以及菌落的大小和形状。

甘露醇盐琼脂培养基对革兰氏阳性微生物具有选择性，能够在 6.5% 氯化钠。在本实验中，这意味着革兰氏阴性大肠杆菌和寻常假单胞菌由于盐浓度高而没有生长。然而，表皮链球菌和金黄色葡萄球菌能够生长，证实它们是革兰氏阳性。此外，这两个物种之间存在明显差异，因为金黄色葡萄球菌能够发酵甘露醇，由于发酵的酸副产物，将培养基中的甲基红指示剂变成亮黄色。这在 S. epidermis 的情况下没有看到。

另一方面，EMB 培养基对革兰氏阴性菌具有选择性，因为伊红和亚甲蓝染料对革兰氏阳性细胞有毒。革兰氏阴性菌的外膜阻止这些有毒染料进入细胞，这意味着它们能够生长。此外，该培养基表明存在的细菌种类是否能够发酵乳糖。在这里，大肠杆菌菌落变成深紫色，有时带有绿色金属光泽，表明发酵。P. vulgaris 在这种培养基上生长，但不发酵乳糖，因此在染料存在下呈现浅粉红色至紫色。在厌氧条件下，TSA 培养基上的细菌种类仍应生长，但与氧气充足的细菌相比，生长速度可能非常差。这是因为没有一个测试物种是专性厌氧菌。

像这样丰富生长环境的实验有助于从混合样品中支持和分离特定物种。它们还可以帮助确定实验室环境中不同细菌物种的最佳生长条件，从而有助于进一步研究。