16S rRNA测序：一种基于PCR技术鉴定细菌物种的方法

1. 设置

1. 操作微生物时，必须遵循良好的微生物学操作规范。所有微生物，尤其是未知样本，均应视为潜在病原体。应采用无菌技术，以避免样本、研究人员或实验室受到污染。在接触细菌前后均应洗手，佩戴手套，并穿戴防护服。
2. 应对基因组DNA提取和PCR产物纯化实验方案进行风险评估。某些试剂可能具有危害性！
3. 16S rRNA测序必须使用纯培养物。在进行基因组DNA提取之前，需确保起始材料完全纯净。可通过划线接种法分离单菌落以获得纯培养。如有需要，可将单菌落分别在平板或液体培养基中进一步培养。
4. 所需实验设备：
   1. 用于PCR的PCR仪。PCR仪的功能是根据预设程序升高或降低温度。在设置程序时，需输入每个PCR步骤的温度和时间参数，以及循环总数。
   2. 琼脂糖凝胶电泳系统。该系统用于根据DNA片段的大小和电荷进行分离。在本实验方案中，琼脂糖凝胶电泳将用于检测提取的基因组DNA和PCR产物的质量。

2. 实验方案

注意： 本演示方案适用于细菌纯培养物的 16S rRNA 基因测序，不适用于宏基因组学研究。

1. 培养细菌以分离基因组DNA（gDNA）。
   1. 在合适的培养基中培养目标微生物。此步骤可使用液体或固体培养基。选择最有利于生长的条件。实验设计时需注意，生长缓慢的细菌可能需要数天才能达到对数后期/稳定期。本方案中，Bacillus subtilis 168 在含LB培养基的摇床培养箱中，于37°C、200 rpm条件下过夜培养。
2. gDNA的提取。
   1. 若细菌在固体培养基上培养，使用无菌接种环刮取部分菌体，并将其重悬于1 mL蒸馏水中。
   2. 若细菌在液体培养基中培养，则取约1.5 mL过夜培养物。
   3. 通过离心（1分钟，12,000 - 16,000 × g）收集菌体，弃去上清液，使用商业试剂盒或标准方法进行gDNA提取 [例如 CTAB总DNA制备法 (13) 或酚-氯仿抽提法 (14)]。本实验中，使用商业试剂盒从1.5 mL的B. subtilis 168过夜培养物（OD₆₀₀ = 1.5）中提取gDNA。
      注意1： 对于某些革兰氏阴性菌，此步骤可省略，直接通过煮沸法释放DNA。将菌体沉淀重悬于蒸馏水中，置于100 °C金属浴中孵育10分钟。
      注意2： 革兰氏阳性菌细胞较难裂解，因此建议选用专为该类细菌设计的gDNA提取方法或试剂盒。
3. gDNA质量检测。
   1. 通过琼脂糖凝胶电泳检测所提取gDNA的质量。首先，将5 µL提取的gDNA与1 µL上样染料（6x）混合，加样至含有DNA染色试剂的0.8%琼脂糖凝胶中。
   2. 加入分子量标准品，电泳运行至染料前沿迁移至凝胶底部。
   3. 电泳结束后，在适当的凝胶成像系统（紫外光或蓝光）下观察结果。gDNA表现为一条浓重的高分子量条带（大于10 kb）。gDNA质量检测示例见图3。
   4. 若gDNA通过质量控制（即 存在清晰的高分子量条带且无明显拖尾现象），则进行系列稀释：先标记3个微量离心管，分别标注为“10x”、“100x”和“1000x”。
   5. 向上述3个管中各加入90 µL无菌蒸馏水。
   6. 取10 µL gDNA溶液加入标记为“10x”的管中。
   7. 充分吹吸混合（即 100 µL总体积），确保溶液均匀。然后从中取出10 µL转移至标记为“100x”的管中。
   8. 按前述方式混匀后，重复操作，将10 µL溶液从“100x”管转移至“1000x”管。这些稀释后的样品将作为PCR反应的模板。

图3：从Bacillus subtilis中提取的基因组DNA的琼脂糖凝胶电泳结果。泳道1：M—分子量标记物（从上到下：10000 bp、8000 bp、6000 bp、5000 bp、4000 bp、3500 bp、3000 bp、2500 bp、2000 bp、1500 bp、1000 bp）。泳道2：gDNA—从Bacillus subtilis中提取的基因组DNA。请点击此处查看该图的放大版本。

4. 通过PCR扩增16S rRNA基因。
   注意：以下PCR方案针对特定的DNA聚合酶和引物对8F - 1492R（见表1）进行了优化。对于每种不同的聚合酶和引物对，均需对方案进行优化。
   1. 将所有试剂在冰上解冻。
   2. 按照表2所示配制PCR主混合液。由于DNA聚合酶在室温下具有活性，因此反应体系的配制必须在冰上进行，i.e. PCR管和反应组分应始终置于冰上。为每个gDNA样本设置一个反应，并设置一个阴性对照反应。阴性对照是指不含gDNA模板的PCR混合液，用于确保反应体系中的其他组分未被污染。
      注意：当样本数量较多时，通常会预先配制主混合液。主混合液是包含除模板外所有反应组分的溶液，有助于减少重复移液操作、避免移液误差，并确保样本间高度一致性。配制主混合液时，将各组分（除DNA模板外）的体积乘以待测样本的数量，在微量离心管中混合所有组分，并用移液器将总体积上下吹打数次以混匀。
   3. 将49 µL主混合液分装至各个PCR管中。
   4. 向含主混合液的PCR管中加入1 µL模板。阴性对照管中加入1 µL无菌水。为确保组分充分混匀，使用设定为30–50 µL的移液器轻柔地上下吹打约10次。
   5. 设置PCR仪程序，如表3所示。
   6. 将PCR管放入PCR仪中并启动程序。
   7. 程序完成后，通过琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物的质量。
   8. 使用8F-1492R引物对进行成功的PCR扩增应产生一条大小约为1.5 kb的单一条带（图4）。若出现其他条带（i.e. 非特异性产物），可通过调整退火温度优化PCR程序。若存在预期大小的单一清晰条带，则进入下一步。本实验中，使用100倍稀释的gDNA模板进行PCR扩增所得产物最佳，因其具有清晰的预期大小条带且无非特异性产物，因此被选中用于纯化并送测序。
   9. 在测序前，必须去除PCR反应中残留的引物、脱氧核糖核苷酸、聚合酶和缓冲液。可使用商业化的PCR产物纯化试剂盒进行PCR产物的分离。将PCR反应液加载到含有DNA结合基质的柱子上，PCR产物会结合在柱子上，而其他组分则随流动相穿过柱子。随后用洗涤缓冲液清洗柱子，最后用选定的缓冲液将DNA洗脱下来。请确认试剂盒提供的洗脱缓冲液适用于测序。
   10. 将纯化后的PCR产物送交DNA测序。遵循所选测序机构对测序样本提交的指导要求。为获得最佳测序覆盖度，建议使用PCR扩增引物（即2.4.1节中使用的相同引物）作为测序引物。本实验中，使用引物8F和1492R对PCR产物进行测序。

组分	终浓度	每反应体积	每 x 个反应体积（主混合液）
5x 反应缓冲液	1x	10 µL	10 µL × x
10 mM dNTPs	200 µM	1 µL	1 µL × x
10 µM 引物 8F	0.5 µM	2.5 µL	2.5 µL × x
10 µM 引物 1492R	0.5 µM	2.5 µL	2.5 µL × x
Phusion 聚合酶	1 单位	0.5 µL	0.5 µL × x
模板 DNA *	-	1 µL	-
ddH2O	-	32.5 µL	32.5 µL × x
总体积		50 µL	49 µL × x

表2： PCR反应组分。* 使用步骤2.3中稀释10倍、100倍或1000倍的基因组DNA。

步骤	温度	时间	循环次数
初始变性	98°C	30 秒
变性	98°C	10 秒	25–30
退火	60°C	30 秒
延伸	72°C	45 秒
最终延伸	72°C	7 分钟
保存	4°C	∞

表3：扩增16S rRNA基因的PCR程序。

图4：使用引物8F和1492R以gDNA为模板扩增的PCR产物的琼脂糖凝胶电泳结果。B. subtilis的gDNA样本（见图3）分别稀释10倍、100倍和1000倍，以测试最佳扩增效果。泳道1：M — 分子量标记物（从上到下：10000 bp、8000 bp、6000 bp、5000 bp、4000 bp、3500 bp、3000 bp、2500 bp、2000 bp、1500 bp、1000 bp、750 bp、500 bp、250 bp）。泳道2： 使用10倍稀释模板的PCR反应。泳道3： 使用100倍稀释模板的PCR反应。泳道4： 使用1000倍稀释模板的PCR反应。泳道5： （C-）阴性对照（无DNA模板的反应）。请点击此处查看该图的放大版本。

3. 数据分析与结果

注意： 使用正向（此处为 8F）和反向（此处为 1492R）引物对 PCR 产物进行测序。因此，将生成两组数据序列，一组对应正向引物，另一组对应反向引物。每条序列至少生成两种类型的文件：i）包含 DNA 序列的文本文件；ii）DNA 色谱图，用于显示测序运行的质量。

1. 对于正向引物，打开色谱图并仔细检查序列。高质量序列的理想色谱图应具有间距均匀的峰，且背景信号极少或没有（图5A）。
2. 如果色谱图质量不高，则应弃用该序列，或根据以下情况对序列文本文件进行修订：
   1. 在整个色谱图中出现双峰表明存在多个DNA模板。当细菌培养物不纯时可能出现这种情况。此类序列应予弃用（图5B）。
   2. 模糊的色谱图可能由同一位置出现不同颜色的峰引起。最常见的错误之一是在同一位置出现两种不同颜色的峰，以及测序软件对碱基的错误指认（图5C）。应手动校正任何错误指认的核苷酸，并在文本文件中进行编辑。
   3. 低分辨率色谱图可能导致“宽峰”，常引起这些区域核苷酸计数错误（图5D）。此类错误难以纠正，因此在后续比对步骤中可能出现的错配不应被视为可靠。
   4. 在序列的5'端和3'端常可见色谱图读取质量差以及多峰现象。某些测序软件会自动去除这些低质量片段（图5E），且这些核苷酸不会包含在文本文件中。如果您的序列未被自动截短，请识别末端的低质量片段（例如 信号微弱、峰重叠、分辨率下降），并从文本文件中删除相应碱基。

图5：DNA测序故障排除示例。A）高质量色谱图序列的示例（峰间距均匀、峰信号明确）。B）通常出现在色谱图起始区域的低质量序列。灰色区域被视为低质量区域，测序软件会自动将其去除；也可手动进一步裁剪更多碱基。C）出现双峰（由箭头指示）。红色箭头所指的核苷酸被测序仪读为“T”（红色峰），但蓝色峰信号更强，也可能被解读为“C”。D）重叠峰表明存在DNA污染（i.e. 模板不止一个）。E）分辨率下降，即所谓的“宽峰”（由矩形标记），导致无法可靠地判读碱基。 请点击此处查看此图的放大版本。

3. 重复步骤3.1和3.2，针对反向引物进行操作。
4. 最后，将正向和反向测序结果拼接成一条连续的序列。一次良好的测序反应可获得长达1100 bp的序列。考虑到PCR产物长度约为1500 bp，使用正向和反向引物获得的序列应存在部分重叠。
   1. 使用DNA序列组装程序合并这两个序列， 例如 一种免费工具，例如 CAP3（http://doua.prabi.fr/software/cap3）（15）。
   2. 将两条序列以FASTA格式插入指定的文本框中。点击“提交”按钮，并等待结果返回。
   3. 在结果标签页中，点击“Contigs”以查看组装后的序列，点击“Assembly details”以查看比对的详细信息。
      注1： 如果使用 CAP3 软件进行重叠群组装，则无需将反向引物序列转换为反向互补序列；但如果使用其他程序，此步骤可能是必需的。
      注释2： FASTA 格式是一种用于表示核苷酸序列的文本格式。FASTA 文件中的第一行（描述行）以符号“>”开头>“，后接序列的名称或唯一标识符。描述行之后是核苷酸序列。请按以下格式粘贴您的序列：
      
      >序列正向引物
      请将文本文件中的序列粘贴至此处
      >序列反向引物
      请在此处粘贴来自文本文件的序列
5. 访问基础局部比对搜索工具（BLAST；https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）网站，进行数据库搜索。
   1. 选择“核苷酸BLAST”工具，将您的序列与数据库进行比对。
   2. 将您的序列（在步骤 3.5 中组装的重叠群）输入“查询序列”文本框，然后在下拉菜单中选择数据库“16S rRNA 序列（细菌和古菌）”。
   3. 点击页面底部的“BLAST”按钮，系统将返回最相似的序列。示例 BLAST 结果如下所示 图6在本实验中，排名最高的结果是 B. subtilis 菌株168，与BLAST数据库中可获取的序列显示100%一致性。
   4. 如果最佳匹配结果未显示100%一致性，请进入比对结果检查错配情况。点击最佳匹配项后，系统将跳转至比对详情页面。比对的核苷酸之间会以短垂直线连接，而错配的核苷酸之间则存在间隙。返回测序公司提供的色谱图，再次仔细核对错配区域的序列。若发现其他错误，应予以修正。使用修正后的序列重新运行BLAST分析。

图6： 核苷酸BLAST结果示例。以枯草芽孢杆菌（B. subtilis）168菌株纯培养物的16S rRNA基因序列作为查询序列。结果显示，与预期一致，排名第一的匹配序列为枯草芽孢杆菌（B. subtilis）168菌株，序列相似性达100%（已加下划线）。请点击此处查看该图的放大版本。