生长曲线：利用菌落形成单位和光密度测量生成生长曲线

1. 设置

1. 所需实验材料：液体培养基、凝固的琼脂培养基、锥形瓶、15 mL 试管、磷酸盐缓冲液（PBS）、细菌涂布器、70% 乙醇和分光光度计。所有溶液和玻璃器皿在使用前必须灭菌。
2. 用 70% 乙醇对工作台进行消毒。在本生灯附近操作，以防止培养基污染。
3. 操作细菌时应使用适当的个人防护装备并遵循无菌操作技术。处理细菌培养物时必须穿戴实验服和手套。
4. 缓冲液、溶液和试剂的配制方法
   1. 磷酸盐缓冲液（PBS）(8)。
   2. LB 培养基（Luria-Bertani Broth）(9)。

2. 实验方案

1. 培养基的制备
   1. 确定用于培养细菌的生长培养基，并分别在可高压灭菌的瓶中制备液体肉汤和固体琼脂（1.5% w/v 琼脂）培养基。此处使用LB肉汤和LB琼脂培养 Escherichia coli。
   2. 将培养基装入瓶中，瓶盖稍松，于121 °C高压灭菌器中灭菌35分钟。
   3. 对于琼脂培养基，高压灭菌后，将其置于50 °C水浴中冷却30分钟。冷却后，向每个100×15 mm圆形培养皿中倒入20–25 mL琼脂培养基。平板在室温下静置24小时后方可使用。
2. 细菌的初始准备
   1. 从冷冻保存的菌种中，在选定的琼脂培养基平板上划线以分离单菌落。在适合目标细菌生长的条件下进行培养。此处将 E. coli 划线接种于LB琼脂平板，并在37 °C下培养过夜（16–18小时）。
   2. 使用无菌接种环，从划线平板上挑取单个菌落，接种至含有4 mL液体培养基的15 mL试管中，并在适合目标细菌的条件下培养。此处将 E. coli 在37 °C、210 rpm振荡条件下培养过夜（16–18小时）。
3. 生长曲线实验设置
   1. 培养瓶的准备
      1. 对适当大小的锥形瓶进行高压灭菌。通常采用培养基体积与锥形瓶总容积1:5的比例。此处使用500 mL锥形瓶装入100 mL LB培养基。
      2. 使用移液管将无菌培养基转移至锥形瓶中。
   2. 稀释系列的制备
      1. 标记15 mL试管为-1、-2、-3、-4、-5、-6、-7、-8和-9，并向每管中加入9 mL PBS。这些数字对应用于计算CFU/mL的稀释倍数。每个取样时间点均需使用一组新的试管。（图2）
   3. 琼脂平板的准备
      1. 在平板上标记取样时间和对应的稀释倍数。每个时间点的每个稀释度均需准备一个平板。
4. 生长曲线实验步骤
   1. 培养基接种
      1. 使用第2.2.2步制备的过夜液体培养物，按1:1000的接种体积将菌液接种至锥形瓶培养基中。此处将100 µL过夜培养液加入100 mL LB培养基中。
      2. 轻轻旋转混匀培养基，使细菌均匀分布。
   2. 时间点取样
      1. 生长条件设置
         1. 将锥形瓶置于目标细菌适宜的实验生长条件下。对于生长迅速的细菌，应频繁取样；对于生长缓慢的细菌，可延长取样间隔。此处 E. coli 在37°C、210转/分钟（rpm）振荡条件下培养，每1小时取样一次。
      2. 光密度（OD600）测定
         1. 在每个时间点（包括起始时间点 t = 0），取出1 mL细菌培养物，加入分光光度计比色皿中。
         2. 擦净比色皿外壁，测定600 nm波长处的光密度值。若OD600读数大于1.0，则取100 µL培养物与900 µL新鲜培养基按1:10稀释，测定光密度后将读数乘以10，作为最终OD600值。
      3. 菌落形成单位（CFU/mL）测定
         1. 在每个时间点，取出1 mL细菌培养物，加入标记为-1的玻璃试管（内含9 mL PBS）中。
         2. 进行系列稀释：从-1管开始，依次将1 mL菌液转移至后续稀释管（至-9管），每次转移后充分涡旋混匀。（图2）
         3. 对每个稀释度，取100 µL细胞悬液加入相应标记的固体培养基琼脂平板上。（图2）
         4. 使用经乙醇灭菌、通过本生灯火焰灼烧并接触琼脂表面冷却的涂布棒，将100 µL细胞悬液均匀涂布，直至琼脂表面干燥。
         5. 将涂布后的平板倒置，置于适合细菌生长的温度下培养。此处 E. coli 在37°C下培养。
         6. 培养结束后，待菌落清晰可见时，计数每个平板上的细菌菌落数量，并记录各时间点所有平板的菌落数及其对应的稀释倍数。

3. 数据分析与结果

1. 光密度（OD600）生长曲线图
   1. 以半对数坐标绘制光密度（OD600）随时间的变化曲线。（图3）
2. 菌落形成单位（CFU/mL）生长曲线图
   1. 针对每个时间点，选择菌落数在30–300个之间的稀释平板。将菌落数乘以稀释倍数，再乘以10，因为涂布的100 µL样品在计算CFU/mL时被视为额外的1:10稀释。
      
   2. 以半对数坐标绘制菌落形成单位随时间的变化曲线。（图4）
3. 光密度与菌落形成单位的关系
   1. 以线性坐标绘制菌落形成单位与光密度的关系，仅使用OD600 ≤ 1.0的数据点，因为在OD600超过1.0时，OD600与CFU/mL之间的相关性准确性下降。此处绘制了前六个时间点的数据。（图5）
   2. 生成线性回归趋势线，并显示方程和R²值。
4. 测定细菌倍增时间
   1. 利用菌落形成单位的生长曲线图，在对数生长期选择曲线上斜率最陡的两点，用于计算倍增时间。
   2. 倍增时间的计算
      1. 
      2. ΔTime = t₂ - t₁，其中t₁为时间点1，t₂为时间点2
      3. ，其中b为t₂时刻的细菌数量，B为t₁时刻的细菌数量，n为代数。该式推导自：。
      4. 使用以下公式计算倍增时间：