What are the four phases of a bacterial growth curve?

A typical bacterial growth curve progresses through four distinct phases. Lag phase is when bacteria adjust to their environment before rapid growth begins. Exponential phase follows, characterized by rapid cell division and doubling. Stationary phase occurs when growth plateaus due to nutrient depletion. Finally, death phase involves cell lysis from severe nutrient limitation.

How do colony forming units differ from optical density measurements?

Colony forming units (CFUs) provide direct bacterial cell counts through serial dilution and plate counting, yielding precise CFU/mL values. Optical density measures light absorbance at 600 nanometers (OD600) using a spectrophotometer, offering instant results with fewer reagents. While OD600 is faster and more convenient, CFUs are more accurate, especially at higher cell densities.

Why is the 30-300 colony range important when counting plates?

The 30-300 colony range minimizes counting error when calculating CFU/mL. Plates with fewer than 30 colonies show high stochastic variation, leading to unreliable estimates. Plates exceeding 300 colonies suffer from crowding and overlapping, causing underestimation. Using plates within this optimal range ensures accurate bacterial enumeration for each time point.

What is doubling time and how is it calculated?

Doubling time is the fastest rate at which bacteria reproduce under specific growth conditions, measured during the exponential phase. To calculate it, identify two time points with the steepest slope, then compute the change in time and change in generations using the bacterial counts at each point. Dividing time change by generation change yields doubling time, allowing comparison of growth conditions.

How does a standard curve relate optical density to colony forming units?

A standard curve plots CFU/mL against OD600 on a linear scale for readings at or below 1.0 OD600. A linear regression equation (Y = MX + B) is generated, where M is the slope and B is the y-intercept. This relationship allows researchers to estimate CFU/mL from OD600 measurements in future experiments, saving time and materials while maintaining accuracy.

What preparation steps are necessary before measuring bacterial growth?

First, prepare LB broth and agar media in separate bottles, then sterilize in an autoclave at 121°C for 35 minutes. Cool agar to 50°C and pour into Petri dishes. Using pure cultures and streak plating isolation of single bacterial colonies, inoculate liquid media overnight at 37°C with shaking. Finally, inoculate a sterile flask with a 1:1000 volume of the overnight culture to begin growth curve measurements.

Why does the relationship between OD600 and CFU/mL deteriorate at higher optical densities?

The OD600-to-CFU relationship becomes less accurate above 1.0 OD600 because bacterial cells begin changing shape and accumulating extracellular products in the media. These changes influence light absorbance readings independently of actual cell count, causing the spectrophotometer measurement to diverge from true bacterial enumeration. This error becomes pronounced during stationary and death phases.

生长曲线:使用菌落成形单位和光学密度测量生成生长曲线

0 views12:15 min

1. 设置

所需的实验室材料:液体介质、凝固琼脂介质、Erlenmeyer烧瓶、15 mL试管、磷酸盐缓冲盐水（PBS）、细菌细胞扩散器、70%乙醇和分光光度计。所有溶液和玻璃器皿在使用前都必须消毒。
使用 70% 乙醇进行消毒，为工作站做好准备。在 Bunsen 燃烧器附近工作，以防止介质污染。
使用细菌时，应使用适当的个人防护设备和无菌技术。使用细菌培养物时，需要实验室外套和手套。
缓冲剂、溶液和试剂的配方
1. 磷酸盐缓冲盐水（PBS）（8）。
2. 卢里亚-贝尔塔尼兄弟（LB）（9）。

2. 议定书

媒体准备
1. 识别生长介质，用于培养细菌，并在单独的可高压灭菌瓶中制备液体肉汤和固体琼脂（1.5% w/v琼脂）培养基。在这里，LB肉汤和LB琼脂为大肠杆菌的生长做好了准备。
2. 在设置为 121°C 的高压灭菌器中，用半紧固盖对介质进行消毒 35 分钟。
3. 对于琼脂介质，在高压灭菌后，放入设置为 50°C 的水浴中 30 分钟冷却。冷却后，将 20-25 mL 琼脂胶培养基倒入 100x15mm 圆形培养皿中。在使用前，让板在室温下设置24小时。
细菌的初始制备
1. 从冷冻库存中，条纹细菌在选定的介质琼脂上分离，以获得单菌群分离物。在允许为所选细菌生长条件下孵育。在这里，大肠杆菌在LB琼脂上条纹，在37°C过夜（16-18小时）孵育。
2. 使用无菌接种回路，从条纹板中选择单个菌落，在15 mL试管中接种4 mL液体介质，并在所选细菌允许的条件下生长。在这里，大肠杆菌在37°C下生长，在210rpm的转速下摇动过夜（16-18小时）。
增长曲线设置
1. 生长瓶制备
  1. 高压灭菌器适当大小埃伦迈耶烧瓶。通常使用 1:5 的介质与总烧瓶体积的比率。在这里，100 mL LB 介质用于 500 mL 烧瓶。
  2. 使用血清学移液器，将无菌介质转移到 Erlenmeyer 烧瓶。
2. 稀释系列制备
  1. 标签 15 mL 试管: -1， -2， -3， -4， -5， -6， -7， -8 和 -9，将 9mL PBS 分布到每个。这些数字对应于用于计算 CFU/mL 的稀释系数。每个收集时间点都需要一组新的管。（图2）
3. 阿加板制备
  1. 带有收集时间和稀释系数的标签板。对于每个时间点，每个稀释都有一个板。
增长曲线协议
1. 媒体接种
  1. 使用步骤 2.2.2 中准备的隔夜液体培养液，用 1:1000 容量的培养液为烧瓶介质接种。在这里，100 μL 隔夜液体培养剂添加到 100 mL LB 介质中。
  2. 旋转介质以均匀分布细菌。
2. 时点集合
  1. 生长条件设置
    1. 在为给定细菌选择的实验生长条件下放置烧瓶。对于快速生长的细菌，应经常使用时间点，对于生长缓慢的细菌，可以以较长的间隔进行。在这里，大肠杆菌在37°C下生长，以每分钟210转（rpm）摇动，每1小时采集一次时间点。
  2. 光学密度（OD600）测量
    1. 在每个时间点，包括起始时间点（t = 0），提取1 mL的细菌培养物，并分配到分光光度计比色皿中。
    2. 擦拭比色皿，并将光密度记录在 600 nm 波长。如果光学密度读数大于 1.0，则使用 900 μL 新介质稀释 100 μL 培养物 1:10，记录光学密度，并将此值乘以 10 进行 OD600 测量。
  3. 殖民地形成单元（CFU/mL）测量
    1. 在每个时间点，提取1 mL的细菌培养物，并放入含有9 mL PBS的-1玻璃试管中。
    2. 对于稀释系列，从 -1 管将 1 mL 从 -1 管向下所有稀释管转移到 -9，每次传输后涡旋。（图2）
    3. 对于每次稀释，将100 μL的细胞悬浮液分给相应标记的固体介质琼脂板。（图2）
    4. 使用在乙醇中灭菌、通过 Bunsen 燃烧器火焰并通过接触琼脂表面冷却的细胞扩张器，将 100 μL 的细胞悬浮液扩散，直到琼脂板表面变干。
    5. 在支持细菌生长的温度下倒置孵育扩散板。在这里，大肠杆菌在37°C孵育。
    6. 孵育后，一旦出现可见的菌落，计算每个板块上的细菌菌落数量，并记录这些值以及每个时间点所有板的相关稀释系数。

3. 数据分析和结果

光密度（OD600）增长曲线图
1. 在半对数尺度上绘制光学密度（OD600）与时间。（图3）
菌落形成单元（CFU/mL）生长曲线图
1. 对于每个时间点，选择菌落计数在 30-300 细菌范围内的稀释板。将菌群计数数乘以稀释系数，再乘以 10，因为 100 μL 差差在计算 CFU/mL 时被视为额外的 1:10 稀释。
2. 在半日志尺度上绘制殖民地形成单位与时间。（图4）
相关光学密度和菌落形成单元
1. 在小于或等于 1.0 OD600 的 OD600 读数的线性刻度上绘制菌落成形单元与光学密度，因为 OD600 和 CFU/mL 之间的关系在 1.0 OD600 之后的精确度较低。此处绘制了前六个时间点。（图5）
2. 生成显示方程和 R²值的线性回归趋势线。
确定细菌翻倍时间
1. 使用菌落形成单位生长曲线图，在指数相中，在图形上识别两个点，它们之间的斜率最陡，以计算倍增时间。
2. 计算加倍时间
  2. • 时间= t₂ - t₁，其中t₁ = 时间点 1 和t₂ = 时间点 2
  3. ，其中b = t₂的细菌数，B = t₁的细菌数，n = 代数的细菌数。派生自: .
  4. 使用: