抗生素敏感性试验：采用Epsilometer试验测定两种抗生素的最小抑菌浓度（MIC）值并评估抗生素协同作用

1. 最小抑菌浓度测试（E-测试）

1. 实验准备
   1. 佩戴手套和实验服
   2. 使用70%乙醇对工作区域进行消毒，准备好实验台
   3. 准备 Mueller-Hinton 琼脂平板（MHA 平板）
2. 制备 0.5 号麦氏比浊标准液
   1. 制备1%氯化钡（BaCl₂）溶液：
      将1克无水氯化钡（BaCl₂）加入100 mL蒸馏水中，充分涡旋混匀。
   2. 制备1%硫酸（H₂SO₄）溶液：
      将1 mL浓硫酸（H₂SO₄）加入99 mL蒸馏水中，充分涡旋混匀。
   3. 制备0.5号麦氏比浊标准液：
      取50 µL BaCl₂溶液加入5 mL 1% H₂SO₄溶液中，充分涡旋，形成浑浊悬液。
   4. 将0.5号麦氏比浊标准液置于铝箔包裹的试管中，于25°C保存，最长不超过6个月。使用前充分涡旋至均匀。
3. 制备 MHA 平板
   1. 用无菌接种环从血琼脂平板上刮取Streptococcus G群细菌，混入1 mL生理盐水中，涡旋混匀制成菌悬液。
   2. 将菌悬液与0.5号麦氏比浊标准液比较，调整浊度一致，以确保实验中接种量相同。根据需要添加生理盐水或细菌调节浓度。
   3. 使用无菌棉签蘸取菌液，在MHA平板表面均匀涂布。随后采用以下三种方法之一进行实验（1.4–1.6）。
4. 单一抗生素耐药性测试。Streptococcus G群细菌对青霉素G或庆大霉素的耐药性
   1. 将E-test试纸条（青霉素G或庆大霉素）置于MHA平板中央（图1 A,B）。
   2. 在37°C下孵育18–20小时。
   3. 读取结果。最小抑菌浓度（MIC）为抑菌圈与梯度抗生素试纸条交界处的数值（图1 C,D）。

图1：单个E-test。 将 A) 青霉素G 和 B) 庆大霉素的E-test试纸条放置于涂布有G群链球菌菌落的Mueller Hinton琼脂平板上，在37°C、5% CO₂条件下过夜培养前（A 和 B）及培养后（C 和 D）的结果。请点击此处查看该图的放大版本。

5. 协同作用测试交叉法。 Streptococcus G群，对青霉素G和庆大霉素耐药。
   1. 将含有不同抗生素的两根E-test试纸条（例如青霉素G和庆大霉素）以交叉形式放置在接种好的MHA平板上。
      1. 为获得最准确的结果，应尽量使两根试纸条在交叉处呈约90°角，交叉点位于各自最小抑菌浓度（MIC）值刻度线的交点处，该MIC值此前已通过单种抗生素耐药性试验确定（图2 A）。
      2. 注意，一旦试纸条放置于琼脂平板上，便不应再移动，因为部分抗生素可能已被培养基吸收。因此，若角度略有偏差（如85°），或交叉点偏离实际MIC值1-2 mm，也应保持试纸条不动。建议将实验重复三次，以减少此类误差。
   2. 在37°C下孵育18-20小时。
   3. 读取结果。最小抑菌浓度（MIC）的测定依据为抑菌圈与每根E-test试纸条上梯度抗生素浓度刻度相交的位置（图2 B）。
   4. 使用部分抑菌浓度（FIC）计算公式（公式1）来判断是否存在协同作用。

图2：协同作用检测——交叉试验。 青霉素G与庆大霉素对G群链球菌的最低抑菌浓度（MIC）协同抗菌试验结果，分别为37°C、5% CO₂条件下培养过夜前（A）和培养过夜后（B）。两种药物各自的MIC值之间形成90°夹角（青霉素G：0.094 µg/mL，庆大霉素：8 µg/mL）。请点击此处查看该图的放大版本。

6. 协同作用测试非交叉法。 Streptococcus G群，对青霉素G和庆大霉素耐药。
   1. 将E-test试纸条置于MHA平板中央（图3 A,D）。
   2. 标记出此前已确定的每条试纸条上的MIC值位置。
   3. 在室温下孵育1小时。
   4. 移除每块MHA平板上的E-test试纸条（图3 B,E）。
   5. 将第二条E-test试纸条（含有另一种抗生素）分别放置在先前移除试纸条的位置，使两条试纸条的MIC值对齐所做标记并保持平行。
   6. 在37°C下孵育18–20小时。
   7. 读取结果。MIC值测定为每个E-test试纸条上抑菌浓度梯度试纸与抑菌圈相交处的数值（图3 C,F）。
   8. 为确定协同作用，使用部分抑菌浓度（FIC）计算公式（公式1）。

图3：协同作用检测——非交叉试验。 青霉素G与庆大霉素对G群链球菌的最低抑菌浓度（MIC）协同抗菌试验结果。A) 庆大霉素纸片（中心浓度8 µg/mL）置于G群链球菌表面，B) 移除庆大霉素纸片，C) 联合庆大霉素/青霉素G纸片（中心浓度0.094 µg/mL）置于G群链球菌表面，D) 青霉素G纸片（中心浓度0.094 µg/mL），E) 移除青霉素G纸片，F) 联合青霉素G/庆大霉素纸片（中心浓度8 µg/mL）置于G群链球菌表面。请点击此处查看该图的放大版本。

2. 肉汤试验

1. 设置
   1. 佩戴手套和实验服
   2. 使用70%乙醇对工作区域进行消毒，准备实验台面
   3. 收集含50%裂解马血和20 mg/mL β-NAD的15 mL MH肉汤（MH-F）
2. （可选）进行E-test [方案1]，以测定固体培养基上的最低抑菌浓度（MIC）
   1. 尽管此步骤为可选，但获得该信息有助于优化实验设计（例如，可根据平板测定的MIC值设定抗生素添加浓度，使其围绕该值），从而提高实验成功的可能性。
3. 制备细菌接种物。 如上所述，细菌浓度可通过OD nm测定或McFarland比浊标准进行估算
   1. OD600 nm法
      1. 获取已知细菌浓度的细菌悬液
      2. 将菌液用MH-F肉汤稀释，使OD600达到0.003
   2. McFarland比浊法
      1. 在无菌试管中加入15 mL MH-F肉汤
      2. 从平板取细菌接种至MH-F肉汤中，达到McFarland标准浊度。剧烈涡旋混匀后，将溶液倒入无菌培养皿中
4. 准备抗生素
   1. 确定所需抗生素浓度
      1. 从E-test中获取MIC值（例如，青霉素G为0.125 µg/mL，庆大霉素为8 µg/mL）
      2. 将琼脂平板MIC值乘以2⁴–2⁷，对应四到七次2倍倍比稀释，所得结果即为抗生素的起始浓度（例如，青霉素G进行七次2倍稀释：0.125 µg/mL × 2⁷ = 16 µg/mL；庆大霉素进行四次2倍稀释：8 µg/mL × 2⁴ = 128 µg/mL）
      3. 将所需起始浓度扩大100倍，以确定抗生素的储备液浓度（例如，青霉素G储备液为1.6 mg/mL，庆大霉素储备液为12.8 mg/mL）
   2. 据此配制100倍浓度的抗生素储备液
      1. 将抗生素溶解于10 mL经高压灭菌的水中，并涡旋混匀以制备储备溶液（例如，使用16 mg青霉素G和128 mg庆大霉素制备上述储备液）
5. 将细菌加入微孔板孔中
   1. 将含有细菌接种物的200 µL MH-F肉汤分装至96孔微量滴定板前3行的各孔中，每组实验设三个重复。
6. 将抗生素加入微孔板孔中
   1. 向第一列孔（A1、B1、C1）中额外加入200 µL含细菌的MH-F肉汤，使总体积达到400 µL。
   2. 向第一列孔中加入4 µL抗生素储备液。由于样品总体积为400 µL，抗生素将被稀释100倍。
   3. 通过将200 µL菌液/抗生素混合液从A1转移至A2，依次至A11，进行2倍倍比稀释。每次转移后需充分吹打混匀。对其他行重复此操作。
   4. 从第11列孔中移除200 µL液体，使所有孔的最终体积均为200 µL。
   5. 最后一列（A12、B12、C12）不加抗生素，作为空白对照。
7. 确定MIC值
   1. 将96孔微量滴定板在37°C下静置培养24小时。
   2. MIC值定义为稀释系列中最后一个无可见细菌生长的孔（图4）。然而，该数值的可靠性依赖于初始接种量的准确性。

图4：通过肉汤稀释法测定最低抑菌浓度（MIC）。 此处MIC定义为在由澄清变为浑浊前最后一个保持澄清的孔（即无细菌生长）。每行分别为青霉素G的MIC值重复孔和庆大霉素的MIC值重复孔，两者均针对一株G群链球菌（Streptococcus group G）分离株。 A) 实际实验结果，B) 对A中结果的示意图解（灰色 = 无生长；白色 = 有生长）。 请点击此处查看该图的放大版本。

图5：用于测定原始细菌浓度的系列稀释示意图。 按照所述方法进行稀释（20 µL样品加入180 µL中，形成10倍系列稀释），然后从A-H各列取10 µL分别涂布于两个独立的血琼脂平板上，如图所示。 请点击此处查看该图的放大版本。

8. 确定初始接种量大小
   注意：微量肉汤稀释法对抗生素敏感性试验中所用的初始接种量大小极为敏感。若接种量过大，会导致假阳性结果，因为在此比例下添加的抗生素将无法再抑制细菌生长。因此，验证加入微孔板中的细菌数量至关重要。尽管该数据在实验进行时无法获得（由于需要24小时培养），但其可作为对照使用。若加入的细菌数量处于规定浓度范围内，则最小抑菌浓度（MIC）值可信。若接种量过高或过低，则需重复实验。
   1. 对细菌进行系列稀释
      1. 准备一块96孔微孔板，用于稀释原始细菌浓度以确定接种量大小。理想终体积为200 µL，含细菌10^5-6个。进行稀释时，首先在B-H列的每孔中加入180 µL无菌PBS（每组设三个重复孔，即1-3行）。
      2. 接着，在A列的每孔（三个重复孔，即1-3行）中加入100 µL细菌溶液。
      3. 通过将20 µL细菌液从A列转移至B列并剧烈吹打，进行10倍系列稀释（设三个重复）。依次重复此步骤至H列。
   2. 接种稀释后的细菌以测定接种量大小
      1. 根据图5标记血琼脂平板。
      2. 根据图5所示，将10 µL系列稀释液点种至平板上。
      3. 将平板在37°C下培养20–24小时。
   3. 确定细菌接种量大小
      1. 计数每个点上菌落数在5–50之间的菌落数量（图6）。
      2. 通过计算三个重复样本的平均值，乘以稀释倍数（例如B组样本为10倍，C组为100倍，D组为1000倍，依此类推），再乘以100（以校正10 µL点种体积），得到接种量（单位：cfu/mL）。若接种量在10^5-6 cfu/mL范围内，则MIC数据可信。

图6：接种量的确定。 按照图5接种的细菌在37°C下培养20-24小时，然后进行计数。D行的菌落数量适中（例如5-50个），适合计数。A组样品未稀释，B组稀释10倍，C组稀释100倍，D组稀释1000倍，每点接种量为10 µL。请点击此处查看该图的放大版本。