显微镜观察与染色：革兰氏染色、荚膜染色与芽孢染色

1. 革兰氏染色

1. 准备工作
   1. 佩戴手套和防火实验服，因为染料会污染手部和衣物。
   2. 使用本生灯对细菌进行热固定。操作火焰时需小心；长发应束起。
   3. 使用市售的革兰染色试剂。
   4. 用实验室擦拭纸清洁显微镜载玻片。
2. 实验步骤
   1. 用移液器吸取 10 µL 磷酸盐缓冲液或培养液滴加到载玻片上。
   2. 将一个细菌菌落涂抹于液体中，形成一层薄而均匀的涂片。
      注意：不要使用超过 24 小时的培养物，因为过老的细菌可能细胞壁结构发生变化，从而影响革兰染色结果（1, 4）。
   3. 将载玻片完全自然晾干。
   4. 干燥后，将载玻片（菌面朝上）在火焰中通过 4–5 次，以完成热固定。
      注意：切勿将载玻片在火焰中停留过久，否则可能导致细菌细胞变形（1）。
   5. 在水槽上方操作，保持载玻片水平，滴加结晶紫染液，完全覆盖已热固定的细菌区域，静置 45 秒。
   6. 将载玻片倾斜，用柔和、间接的水流冲洗多余结晶紫染液，使水流沿载玻片表面流过染色区域。切勿直接将水流对准细菌区域冲洗。
   7. 再次保持载玻片水平，滴加卢戈碘液，完全覆盖染色后的细菌区域，静置 45 秒。
   8. 参照步骤 1.2.6 的方法冲洗多余的碘液。
   9. 保持载玻片倾斜，滴加数滴脱色剂，使其缓慢流过染色区域，直至流出液无色为止（通常约 5 秒）。立即参照步骤 1.2.6 的方法用水冲洗。
      注意：此步骤是整个实验的关键。脱色时间过长或过短均可能导致革兰染色结果错误（4）。
   10. 再次保持载玻片水平，滴加沙黄染液，完全覆盖细菌区域，静置 45 秒。
   11. 参照步骤 1.2.6 的方法冲洗多余的沙黄染液。
   12. 用纸巾轻轻吸干载玻片上的多余水分，切勿擦拭。
   13. 使用油镜配合 100X 物镜在显微镜下观察样本。
3. 结果与数据分析
   1. 革兰阳性菌呈紫色。
   2. 革兰阴性菌呈红色。
   3. 可观察到细菌的形态（球菌、杆菌、弯曲杆菌、螺旋状菌）。
   4. 可观察到细菌细胞的排列方式（单个细胞、成对细胞、链状排列、簇状排列、成团分布）。

2. 荚膜染色

1. 准备
   1. 佩戴手套和实验服，因为染料会污染手部和衣物。
   2. 配制1%结晶紫溶液：将0.25克结晶紫溶于25 mL蒸馏水中，搅拌至完全溶解。
   3. 配制1%刚果红溶液：将0.25克刚果红溶于25 mL蒸馏水中，搅拌至完全溶解。
   4. 用实验室擦拭纸清洁载玻片。
2. 实验步骤
   1. 在载玻片上滴加10 µL刚果红溶液。
   2. 用移液器吸头将细菌菌落与染料混合，涂布成一层薄而均匀的菌膜。
   3. 将载玻片上的染料-细胞混合物在空气中完全干燥，需5–7分钟。
      注意：切勿加热固定，因为加热可能导致荚膜脱水或变形。
   4. 用1%结晶紫溶液覆盖涂片，染色1分钟。
   5. 冲洗多余染液时，将载玻片倾斜放置，用柔和、间接的水流冲洗载玻片表面，使水沿涂片流下，覆盖染色的细菌区域。切勿将水流直接喷射到细菌上。
   6. 将载玻片保持45度角，直至完全空气干燥。
   7. 在显微镜下使用油镜和100X物镜观察涂片。
3. 结果与数据分析
   1. 细菌细胞呈紫色。
   2. 载玻片背景被染成深色。
   3. 荚膜表现为细胞周围在深色背景上的透明晕圈。

3. 芽孢染色（Schaeffer-Fulton 法）

1. 准备工作
   1. 佩戴手套和防火实验服，以保护双手和衣物免受染料和火焰伤害。
   2. 使用本生灯对细菌进行热固定。操作火焰时需小心；长发应束起。
   3. 配制0.5%孔雀绿溶液：将0.125克孔雀绿与25 mL蒸馏水混合，搅拌至完全溶解。
   4. 使用市售的革兰氏沙黄试剂溶液。
   5. 用实验室擦拭纸清洁载玻片。
2. 实验步骤
   1. 用移液器吸取10 µl磷酸盐缓冲液（PBS）或培养液滴加到载玻片上。
   2. 采用无菌操作技术，将一个细菌菌落涂抹入液滴中，制成一层薄而均匀的涂片。
      注意：芽孢通常不在幼龄细胞中形成，因此建议使用培养18至36小时的菌种（9）。
   3. 将载玻片完全自然晾干。
   4. 将载玻片（细菌面朝上）通过火焰4–5次，进行热固定。
   5. 为防止染液扩散，将一张裁剪至合适大小的滤纸覆盖在已热固定的涂膜上。
   6. 用孔雀绿溶液充分浸湿滤纸。
   7. 将载玻片置于加热板上盛有沸水的烧杯上方，蒸染5分钟，并根据需要逐滴补充染液，以保持滤纸湿润。
      注意：避免过度加热或使染液干涸。
   8. 从烧杯中取出载玻片，移除并丢弃滤纸，静置冷却2分钟。
   9. 倾斜持握载玻片，用柔和的间接水流彻底冲洗，使水沿涂片表面流下。
   10. 水平持握载玻片，用沙黄试剂完全覆盖涂膜，静置1分钟。
   11. 参照上述步骤3.2.9的方法冲洗掉多余的沙黄染液。
   12. 自然晾干。
   13. 使用100X油镜在显微镜下观察载玻片。
3. 结果与数据分析
   1. 芽孢呈绿色。
   2. 营养细胞呈红色。
   3. 部分营养细胞内含有芽孢；此时细胞呈红色，而芽孢呈绿色。