转化 E. coli 使用改良氯化钙法转化细胞

本方案描述了利用氯化钙法的改良方法制备和转化感受态E. coli DH5α的操作步骤（12）。

1. 设置

1. 仪器设备
   • 分光光度计
   • Sorval 离心机（或同等设备）
   • 台式离心机
   • 加热块或水浴锅
   • 旋转摇床
   • 恒温培养箱
   • 凝胶制备板
   • 加样孔梳子
   • 电压源
   • 电泳槽
   • 紫外光源
   • 微波炉
2. 溶液与试剂
   • LB 培养基（每 1000 mL H₂O 中含 10 g 酪蛋白酶水解物、5 g 酵母提取物和 5 g 氯化钠）
   • SOC 培养基（每升含 2% (w/v) 胰蛋白胨、0.5% (w/v) 酵母提取物、10 mM NaCl、2.5 mM KCl、10 mM MgCl₂、10 mM MgSO₄ 和 20 mM 葡萄糖）
   • CaCl₂-MgCl₂ 溶液（80 mM MgCl₂，20 mM CaCl₂）
   • 1 M CaCl₂ 溶液（若立即进行转化），或含 10% (v/v) 甘油的 0.1 M CaCl₂ 溶液（若需将细胞冷冻保存以备后续使用）
   • LB 琼脂平板
   • LB 选择性琼脂平板（本实验中，由于所用质粒具有氨苄青霉素抗性，因此使用含氨苄青霉素 100 µg/mL 的 LB 琼脂平板）
   • E. coli DH5α 菌株
   • pUC19 质粒 DNA（100 pg/µL）
   • QIAprep Spin Miniprep 试剂盒（Qiagen）
   • HindIII 限制性内切酶
   • 1 kb plus DNA Marker
   • 低熔点琼脂糖
   • 1× TAE 缓冲液（40 mM Tris 碱，20 mM 乙酸，1 mM EDTA）
   • 溴化乙锭（10 mg/mL）
3. 一般安全注意事项
   E. coli DH5α 属于生物安全等级 1 级（BSL1）。该类微生物对健康成人几乎不构成感染风险。然而，操作时仍需谨慎处理该微生物。

重要提示：本方案中的所有步骤均需在无菌条件下操作，并在冰上或4°C环境中进行，除非另有说明。

2. 实验方案

1. 从保存在20%甘油中的大肠杆菌（E. coli）DH5α冻存菌种（LB培养基中过夜培养后制备）中，划线接种至LB琼脂平板上以分离单菌落。37°C培养过夜（16–20小时）。
2. 挑取单个菌落接种于试管中含3 mL LB液体培养基的培养管中。在37°C、210 rpm振荡条件下培养过夜（16–20小时）。
3. 测定过夜培养物的OD600值。用该过夜培养物接种100 mL LB液体培养基于1 L锥形瓶中，使初始OD600=0.01。在37°C剧烈振荡（210 rpm）培养，每15–20分钟用分光光度计监测OD600值，直至培养物达到OD600=0.35（约3小时）。
   注意：为保证转化效率，细菌细胞必须处于对数生长中期。细胞密度最大应为10⁸个细胞/mL，对于大多数大肠杆菌（E. coli）菌株，此值对应OD600=0.4。使用分光光度计测量OD600可准确判断细胞所处的生长阶段。若本方案用于其他细菌菌株，需通过校准实验确定特定OD600值对应的菌落形成单位（CFU）数量，以建立该相关性。
4. 将50 mL培养液转移至两个预冷的聚丙烯离心管中。将离心管置于冰上冷却20分钟。
5. 在4°C条件下，以2700g（Sorval GSA转子4100 rpm）离心10分钟，收集菌体。
6. 移除上清液。将离心管倒置于吸水纸或滤纸上，彻底去除残留液体。
7. 将每个菌体沉淀重悬于30 mL预冷的CaCl₂-MgCl₂溶液（80 mM MgCl₂，20 mM CaCl₂）中。先加入5 mL溶液，轻轻涡旋至沉淀完全溶解，再加入剩余25 mL溶液。
8. 重复步骤2.4。
9. 重复步骤2.5。
10. 若需立即进行转化，将每个菌体沉淀轻轻涡旋重悬于2 mL预冷的0.1 M CaCl₂溶液中。若此方法无法完全重悬沉淀，可轻柔地用移液器上下吹打（避免产生气泡）。
    或者，可将感受态细胞冷冻保存以备后续使用。制备感受态细胞冻存液时，将菌体沉淀重悬于含10%（v/v）甘油的2 mL 0.1 M CaCl₂冰冻溶液中。该溶液必须保持低温。将细胞悬液分装至预冷的1.5 mL聚丙烯离心管中（每管160 µL）。立即置于干冰/乙醇浴中速冻，随后转移至-70°C冰箱保存。
11. 转化CaCl₂处理的细胞时，取50 µL感受态细胞分别加入两个1.5 mL聚丙烯离心管中。向其中一管加入1 µL（100 pg）pUC19质粒DNA，另一管不加DNA作为阴性对照。轻柔混匀（避免产生气泡），冰上孵育30分钟。
    注意：转化时所用DNA量不应超过50 ng，体积不超过10 µL。
12. 将离心管转移至预热的金属浴中，精确在42°C孵育45秒。
    注意：热激是关键步骤，温度和时间均不得超出规定范围。
13. 立即转移至冰上，孵育2分钟。
14. 加入950 µL SOC培养基，37°C孵育1小时，使细菌恢复并表达质粒中编码的抗生素抗性标记。
15. 将10 µL细胞悬液加入1000 µL SOC培养基中（1/100稀释），另取100 µL细胞悬液加入1000 µL SOC培养基中（1/10稀释）。分别取100 µL稀释液及未稀释的对照样品接种至选择性平板上，用涂布棒均匀涂布。通常，接种1/100和1/10稀释度的样品各100 µL，可获得适量的菌落形成单位（cfu）。理想情况下，每板菌落数应在30–300之间，以便于计数且菌落彼此分离。实际cfu数量取决于转化效率（见数据分析与结果部分）。
16. 将平板置于37°C培养。转化成功的菌落应在12–16小时内出现（具体时间取决于菌株类型和筛选方法）。阴性对照平板上不应有菌落生长。
17. 计数转化所得的cfu/板（表1）。
18. 为验证转化子是否携带pUC19质粒，需进行质粒提取及酶切鉴定。为此，挑取单个菌落接种于含3 mL LB液体培养基的试管中。在37°C、210 rpm振荡条件下培养过夜（16–20小时）。
19. 按照试剂盒说明书，使用QIAprep Spin Miniprep试剂盒进行质粒小量提取。
20. 取1 µg纯化的pUC19质粒，用限制性内切酶HindIII在37°C酶切1小时。
    注意：任何可在pUC19多克隆位点内切割的酶均可用于此步骤。

组分	用量
10X 限制性消化缓冲液	2.5 µl
质粒 pUC19	1 µg
HindIII	1 µl
H2O	20.5 µl（定容至 25 µl）

21. 在含有1 µg/mL溴化乙锭的1%琼脂糖凝胶中，以95 V电压电泳1小时，同时上样分子量标记物、经酶切的pUC19 DNA以及等量未经酶切的pUC19 DNA。
    注意：电泳时间与电压可能因所用设备不同而有所调整。
22. 在紫外光下观察凝胶，比较酶切与未酶切pUC19 DNA的大小（图2）（参见数据分析与结果部分）。
    根据各个具体转化实验的目的，进行必要的步骤以验证转化结果。

图2：从转化的DH5α细胞中回收的质粒DNA的酶切分析。 从转化的DH5α细胞中回收质粒DNA，用HindIII进行酶切，于1%琼脂糖凝胶中电泳，并使用紫外光源成像（步骤2.19至2.22）。

3. 数据分析与结果

为了计算转化效率（即细胞摄取外源DNA能力的指标），需要对转化后获得的菌落进行计数：

稀释度	菌落形成单位（Cfu）
1/100	34
1/10	246

表1：转化实验中计数的菌落形成单位（cfu）。

转化效率（TE）是指将 1 µg 质粒转入一定体积的感受态细胞后所产生的菌落形成单位（cfu）的数量。多个参数会影响转化效率：质粒大小、细胞基因型、感受态制备时的生长阶段、转化方法等。在计算 TE 时，需考虑涂板前是否进行了稀释，并将该稀释倍数纳入总 cfu 数量的计算中。转化效率（TE）通过以下公式计算：

首先将菌落形成单位（cfu）除以DNA的微克数，在本例中为0.0001 µg。然后将结果除以稀释倍数。本例中采用了1/10的稀释度，并将1 mL溶液中的100 µL进行涂板（稀释倍数：1/10 × 100 µL / 1000 µL = 0.01）。