接合：一种将氨苄青霉素抗性从供体转移至受体的方法 E. coli

1. 准备工作

1. 高压灭菌约 1 L 的 Luria-Bertani 培养基（LB）。该无菌 LB 将用于配制约 5 mL 含 0.3 mM 二氨基庚二酸（DAP）的 LB 培养基。
2. 准备以下平板：含 1X 四环素（Tet）和 0.3 mM DAP 的 LB 琼脂平板、仅含 1X 四环素（Tet）的 LB 琼脂平板，以及仅含 1X 氨苄青霉素/四环素（Amp/Tet）的 LB 琼脂平板。
3. 确保甘油和一盒预灭菌的塑料移液器吸头就近放置，便于取用。
4. 在开始任何涉及微生物的操作前，使用 70% 乙醇对工作区域进行消毒。始终穿戴必要的个人防护装备，包括实验服和手套。
5. 操作结束后，使用 70% 乙醇对所有表面和手套进行消毒，并洗手。

2. 供体与受体菌株的制备

1. 准备5 mL供体菌株和受体菌株的细菌培养物，在37 °C、220 rpm振荡有氧条件下过夜培养。供体菌株应使用含0.3 mM DAP的LB培养基进行培养。
2. 取1 mL上述两种培养物，以约3000 rpm离心5分钟，收集菌体，并用PBS洗涤细胞。
3. 将细胞重悬于500 µL磷酸盐缓冲液（PBS）中。

3. 偶联

1. 在微量离心管中，将50 µL受体细胞与50 µL供体细胞混合，并用移液器吹打混匀。
2. 将细胞混合物在37 °C下孵育1小时。此步骤可提高接合反应在后续涂板前及过程中的效率。
3. 将100 µL细胞混合物用移液器加至含1X Tet和0.3 mM DAP的琼脂平板上。无需在平板上涂布。
4. 将100 µL受体细胞培养物用移液器加至含1X Tet和0.3 mM DAP的琼脂平板上。无需在平板上涂布。
5. 将两个平板在37 °C下过夜孵育。
6. 用无菌细胞刮刀刮下接合反应的细胞混合物和受体细胞培养物，转移至无菌微量离心管中，并用1 mL PBS重悬细胞。
7. 涡旋振荡细胞，然后轻柔离心（约3000 rpm，5分钟）。
8. 用1 mL PBS重悬细胞。
9. 将接合反应的细胞混合物涂布于仅含1X Amp/Tet的LB琼脂平板上。在此平板上，仅预期成功通过接合获得Amp抗性基因的受体细菌能够生长。
10. 将受体细胞涂布于仅含1X Tet的LB琼脂平板上。在此平板上，仅预期未发生接合、不携带Amp抗性基因的受体细菌能够生长。
11. 将平板在37 °C下过夜孵育。
12. 从两个平板上分别挑取单菌落，用于在5 mL培养基中（37 °C，220 rpm振荡）培养过夜的菌液。

4. DNA 提取

1. 使用总培养液体积中的 4.5 mL，通过质粒小提试剂盒从先前制备的培养物中提取 DNA。
2. 操作时，用 35 µL 无核酸酶的水洗脱 DNA。
3. 纯度良好的 DNA 其吸光度比值（A_260/280）约为 1.8。
4. 取每种培养物剩余的 0.5 mL，与 100% 甘油按 1:1 比例混合，制备甘油保存菌种。
5. 将甘油菌保存于 -80 °C 冰箱中。

5. 通过 PCR 验证质粒接合转移

1. 准备两份PCR主混合液，每份使用不同的正向和反向引物，其中一份引物靶向氨苄青霉素抗性基因内约500个碱基对的片段，另一份引物靶向看家基因内的一个片段。
   1. 看家基因引物设计用于扩增编码DNA旋转酶B的细菌基因内的DNA片段（14）。
   2. 每份主混合液配制90 μL，使用以下试剂体积：
      7.5 μL 的10 μM 正向引物
      7.5 μL 的10 μM 反向引物
      75 μL 的2X PCR主混合液
2. 使用15 μL主混合液、10 ng模板DNA以及无核酸酶水补足至终体积25 μL，配制以下六份PCR反应：
   接合反应DNA与氨苄青霉素引物
   接合反应DNA与看家基因引物
   阴性对照DNA与氨苄青霉素引物
   阴性对照DNA与看家基因引物
   无DNA与氨苄青霉素引物
   无DNA与看家基因引物
3. 将上述反应转移至预热至98 °C的PCR仪中，并按以下条件开始热循环：
   98 °C 预变性30秒
   25–35个循环：98 °C 变性5–10秒，45–72 °C 退火10–30秒，72 °C 延伸每kb 15–30秒
   72 °C 最终延伸5–10分钟
   4 °C 保存
4. 将全部六份PCR反应产物上样至1%琼脂糖凝胶，以约150 V电泳约20分钟。
5. 使用紫外灯观察PCR产物。