接合：一种将氨苄青霉素抗性从供体转移至受体的方法 E. coli

细菌细胞（例如大肠杆菌）能够在细胞之间转移遗传信息。与转导或转化等其他DNA转移机制不同，接合转移需要细胞之间的直接物理接触。

进行接合转移时，需要一个表达育性因子（F因子）的供体细胞和一个不含有该因子的受体细胞，即F⁻细胞。该过程包括两个步骤。第一步是建立直接的细胞间接触。为此，供体细胞会生成一种称为性菌毛的胞外丝状结构。之所以如此命名，是因为接合是无性繁殖细菌的一种交配形式；但需要注意的是，这并非真正的有性生殖，因为不涉及配子的交换，也不会产生后代。

第二步是将 DNA 递送至受体细胞。当性菌毛在两个细胞之间建立接触后，会形成一种称为 IV 型分泌系统的通道，从而实现 DNA 的转移。随后，供体细胞开始复制染色体外 DNA，该复制过程的选择依据是是否存在一种名为 OriT（转移起始位点）的遗传元件。新复制的 DNA 一端通过 DNA-蛋白质结合被穿入该通道中。随着 DNA 进一步复制，它在由位于 OriT 附近基因编码的一组蛋白质复合物的协助下，被泵送通过通道。一旦 DNA 完全转移，它将要么形成染色体外的质粒，要么可能整合到受体细胞的染色体中。无论转移的 DNA 最终处于何种状态，其所编码的基因都将得以表达。这种基因表达可用于确认接合是否成功。

例如，考虑一种情况：供体菌株表达氨苄青霉素抗性，并通过接合转移的 DNA 将这种抗性传递给受体细菌，而受体菌株本身具有供体菌株中不存在的四环素抗性基因。在这种情况下，当细胞被接种到含有氨苄青霉素和四环素的 LB 培养基上时，只有成功完成接合的细菌才能形成菌落，因为这些细菌同时表达两种抗性表型。为进一步确认接合成功，可从这些菌落中提取质粒 DNA，然后利用聚合酶链式反应（PCR）扩增转移质粒中特定的 DNA 片段。当将 PCR 产物与标准分子量标记物一同在电泳凝胶上进行电泳时，凝胶上应可见一条已知大小的 PCR 片段条带，从而进一步证实接合成功。在本实验中，将使用一种质粒通过接合作用将氨苄青霉素抗性基因从供体菌株转移至具有四环素抗性的受体菌株。随后，为验证接合结果，将接合混合物接种到含有两种抗生素的平板上培养，使仅有成功转化的细菌能够生长。最后，通过 PCR 进一步确认接合是否成功。

开始实验操作前，应穿戴适当的个人防护装备，包括实验服和手套。随后，使用70%乙醇对实验台面进行消毒擦拭。

在此实验中，氨苄青霉素抗性基因将通过接合作用从大肠杆菌WM3064菌株转移至大肠杆菌J53菌株。供体菌株WM3064对四环素和氨苄青霉素具有抗性，且生长需要二氨基庚二酸（DAP）。受体菌株J53仅对四环素具有抗性，其生长无需DAP。这意味着成功接合的细胞应同时对四环素和氨苄青霉素具有抗性，并能在不含DAP的条件下生长。

通过取少量冷冻的供体菌株甘油菌种，接种于5毫升含有0.3毫摩尔DAP的LB培养基中，以制备供体菌株培养物。随后，取少量冷冻的受体菌株甘油菌种，接种于5毫升不含DAP的LB液体培养基中，以制备受体菌株。将上述两种培养物置于37°C摇床培养箱中，以220 RPM振荡培养过夜。当培养物生长至OD 600达到2时，分别从每种培养物中取出1毫升，转移至两个新的1.5毫升微量离心管中。随后，将这些样品在3000 RPM下离心5分钟，以沉淀细菌细胞。弃去上清液，并用250微升1×PBS缓冲液洗涤每个沉淀。再次离心样品，弃去上清液后，将每个沉淀重悬于500微升PBS中。

开始接合反应时，首先在1.5毫升微量离心管中将50微升受体细胞与50微升供体细胞混合，并通过轻柔吹打混匀。接着，将100微升受体细胞培养物转移至另一含有DAP的1X四环素平板上。然后，仅取100微升受体细胞培养物，转移至含DAP的非选择性琼脂平板上，作为阴性对照。随后，将接合反应平板和阴性对照平板在37摄氏度下过夜培养。

第二天，使用无菌细胞刮刀从接合平板上收集菌落以收获细胞。然后将菌落转移至含有1毫升1×PBS的无菌1.5毫升微量离心管中。重复此步骤，从另一块平板上收集受体细胞。

此后，涡旋混匀样品。混匀后，将离心管转移至离心机中，轻柔离心使细胞形成沉淀。弃去上清液，然后用一毫升 PBS 重悬细胞沉淀，并涡旋混匀离心管以重新悬浮细胞。再次通过离心收集细胞沉淀。再次弃去上清液，并将两份细胞沉淀均用一毫升 PBS 重悬。接着，使用无菌移液器吸头，取 100 微升接合反应细胞混合物，接种于不含 DAP 并含有 1X 四环素和 1X 氨苄青霉素的 LB 琼脂平板上。再取相同细胞混合物用 PBS 十倍稀释后的 100 微升，重复上述涂布操作，接种于另一块不含 DAP 并含有 1X 四环素和 1X 氨苄青霉素的 LB 琼脂平板上。

最后，用移液器将100微升阴性对照细胞混合物滴加到一个仅含1X四环素的LB琼脂平板上。在37摄氏度下过夜培养后，应可见菌落。使用无菌的移液器吸头，从接合反应平板上挑取单个菌落，并将其加入含有5毫升含两种抗生素的筛选LB培养基的离心管中。然后，从受体细胞平板上选择单个菌落，重复菌落分离操作。将这些培养物在37摄氏度、220 rpm振荡条件下过夜培养。

第二天，用70%乙醇擦拭实验台面，从培养箱中取出培养板。根据试剂盒说明书，使用质粒小提试剂盒从每种培养物的4.5毫升样品中分离质粒DNA。完成质粒小提后，用35微升无核酸酶的水洗脱DNA。最后，取每种培养物剩余的0.5毫升，加入0.5毫升100%甘油，制备1毫升甘油菌保存液，使终浓度为1:1稀释。将这些分装样品置于-80摄氏度冰箱中保存，待后续使用时取出。

为了通过 PCR 确认连接成功，首先在微量离心管中加入 75 微升 2X PCR 预混液，配制 PCR 主混合液。然后，分别加入 7.5 微升 10 微摩尔的正向引物和 10 微摩尔的反向引物，这些引物设计用于扩增质粒上的氨苄青霉素抗性基因。接下来，配制第二份 PCR 主混合液：在另一微量离心管中加入 75 微升 2X PCR 预混液，再分别加入 7.5 微升 10 微摩尔的正向引物和 10 微摩尔的反向引物，这些引物设计用于扩增看家基因（在此例中为 DNA 旋转酶 B 基因）。

现在，向一个PCR管中加入15 µL的第一种主混合液，然后向同一管中加入约2 µL、10 ng的模板实验DNA。用无核酸酶水将反应体系补足至终体积25 µL。重复上述步骤，制备其余五个反应，使各管中含有此处所示的组分。随后，将这些反应液转移至已预热至98 °C的PCR仪中，并启动程序。PCR完成后，从仪器中取出反应管。然后，将每个反应产物2 µL与2 µL上样染料混合，取该混合液以及4 µL分子量标记物，依次加入1%琼脂糖凝胶的相邻加样孔中。将凝胶在150 V电压下电泳20分钟。最后，使用紫外透射仪观察凝胶结果。

在本实验中，通过 PCR 确认了氨苄青霉素抗性基因通过接合转移的成功。此处，在含有接合 DNA 和氨苄青霉素引物的加样孔中（本示例中的第 2 孔）应观察到一条大小约为 500 个碱基对的条带。持家基因 DNA 旋转酶 B 被加样至第 3 孔和第 5 孔，分别含有接合 DNA 和受体细胞 DNA。这些加样孔中出现的条带作为阳性对照，以确保 DNA 模板的存在以及 PCR 反应的成功。在含有受体细胞 DNA 和氨苄青霉素引物对的加样孔（本示例中的第 4 孔）中不应观察到条带，因为受体细胞不具有氨苄青霉素抗性。此外，在未添加模板 DNA 的反应中（本示例中的第 6 和第 7 孔）也不应观察到任何条带。若满足上述条件，则可证实氨苄青霉素抗性基因已成功从大肠杆菌 WM3064 菌株转移至大肠杆菌 J53 菌株，从而使后者获得氨苄青霉素抗性。