噬菌体转导：一种将氨苄青霉素抗性从供体转移至受体大肠杆菌的方法 E. coli

1. 设置

1. 在开始任何涉及微生物的操作之前，使用 70% 乙醇对工作区域进行消毒。始终穿戴必要的个人防护装备（实验服和手套）。
2. 确保 LB 琼脂平板（含 1× 氨苄青霉素）、市售 P1 噬菌体裂解液、氯仿、1 M 柠檬酸钠、甘油，以及一盒预先灭菌的塑料移液器吸头和涂布棒均放置在手边便于取用的位置。
3. 通过高压灭菌制备无菌 LB 培养基，并用其配制三份 1 mL 的 LB 盐溶液。
   1. mM MgCl₂（952.11–2.3803 μg）、5 mM CaCl₂（11.098 mg）、0.1–0.2% 葡萄糖（100–200 μg）
   2. mM MgSO₄（12.0366 mg）、5 mM CaCl₂（11.098 mg）
   3. mM 柠檬酸钠（25.806 mg）
4. 操作结束后，使用 70% 乙醇对所有表面及手套进行消毒，并洗手。

2. 实验方案

1. 供体噬菌体裂解液的制备
   1. 在含有1倍氨苄青霉素的LB培养基中，于37 °C、220 rpm振荡并通气条件下，过夜培养1 mL的供体W3110菌株大肠杆菌（E. coli）。
   2. 将该过夜培养物按1:100稀释至1 mL新鲜LB培养基中，LB培养基中添加10–25 mM MgCl₂、5 mM CaCl₂和0.1–0.2%葡萄糖。
   3. 在37 °C、220 rpm振荡并通气条件下，继续培养该细菌稀释液2小时。
   4. 当细胞进入对数生长期初期（可见明显生长且轻微浑浊）时，加入40 μL市售P1噬菌体，并在37 °C、220 rpm振荡并通气条件下继续培养。
      1. 在加入噬菌体前，细胞在600 nm处测得的光密度值应约为0.4（6）。
   5. 监测培养物1–3小时，直至培养物发生裂解。
      1. 裂解将导致细胞碎片增加，同时浑浊度显著下降（即当培养液变得透明、可透光时，视为细胞已裂解）。
   6. 向裂解液中加入数滴（50–100 μL）氯仿，涡旋混匀。
      1. 氯仿可杀死残留的供体细胞，从而对噬菌体裂解液进行灭菌，仅保留噬菌体，并提高该裂解液的滴度。
   7. 以14,000 rpm离心2分钟，去除碎片，将上清液转移至新离心管中。
   8. 加入数滴氯仿，于4 °C保存不超过一天。
2. 转导
   1. 在LB培养基中，于37 °C、220 rpm振荡并通气条件下，过夜培养1 mL的受体J53菌株大肠杆菌（E. coli）。
   2. 取100 μL供体噬菌体裂解液（2.1）加入1.5 mL微量离心管中，管盖打开，于37 °C孵育30分钟。
      1. 该孵育步骤可使P1裂解液中残留的氯仿充分挥发，避免其对受体细胞造成影响。
   3. 以6,000 rpm离心5分钟，轻柔沉淀受体菌细胞。
   4. 将细胞重悬于300 μL含100 mM MgSO₄和5 mM CaCl₂的新鲜LB培养基中（P1噬菌体需要钙离子以维持感染性）。
   5. 设置两个反应体系，使用受体细菌细胞和制备好的供体噬菌体裂解液：1）转导反应，混合100 μL受体J53菌株大肠杆菌（E. coli）与100 μL供体噬菌体裂解液；2）阴性对照，混合100 μL受体J53菌株大肠杆菌（E. coli）与100 μL含100 mM MgSO₄和5 mM CaCl₂的LB培养基。
   6. 于37 °C、220 rpm振荡条件下孵育30分钟。
   7. 加入1 mL LB培养基和200 μL 1 M柠檬酸钠（pH = 5.5），于37 °C、220 rpm振荡条件下孵育1小时。
      1. 柠檬酸钠通过螯合钙离子降低P1噬菌体的感染性，防止受体细菌被裂解。
      2. 该孵育过程有助于氨苄青霉素抗性标记的表达。
   8. 以6,000 rpm离心5分钟，沉淀细胞。
   9. 将细胞沉淀重悬于100 μL含100 mM柠檬酸钠（pH 5.5）的LB培养基中，涡旋混匀后，将两个反应的全部溶液分别涂布于两块LB琼脂平板上。
      1. 转导样品的LB平板应含1倍氨苄青霉素，阴性对照平板则不含氨苄青霉素。
      2. 若平板上存在P1噬菌体污染，在制备冻存菌种前需重新划线纯化。
      3. 若未去除噬菌体，则从这些菌落生长的培养物仅在钙离子螯合剂存在时才能生长。
   10. 从两块平板上各挑取约3–4个菌落，再次划线接种于两块已涂布100 μL 1 M柠檬酸钠（pH = 5.5）的LB琼脂平板上。
       1. 转导样品的LB平板应含1倍氨苄青霉素，阴性对照平板则不含氨苄青霉素。
   11. 于37 °C过夜培养，使无噬菌体污染的菌落生长。
   12. 从两块平板上分别挑取菌落，接种于5 mL LB培养基中，于37 °C、220 rpm振荡并通气条件下过夜培养。
   13. 使用DNA小提法从这些培养物中提取DNA，取总培养体积中的4.5 mL进行提取。
       1. 使用35 μL无核酸酶水洗脱DNA。
       2. 使用Nanodrop测定所得DNA浓度。纯DNA的吸光度比值（A_260/280）约为1.8。
   14. 取每份培养物剩余的0.5 mL，与等体积100%甘油混合，制备1 mL甘油菌种（1:1比例）。
   15. 将细菌甘油菌种保存于-80 °C。

3. 数据分析与结果

1. 通过qPCR确认转导
   1. 为六次qPCR反应配制两种qPCR主混合液，其中三次使用氨苄青霉素抗性基因的qPCR引物，另三次使用看家基因的qPCR引物（每反应14.5 μL）：12.5 μL qPCR缓冲液混合物 + 1 μL 正向引物 + 1 μL 反向引物。
      1. 本实验中使用了SYBR Green主混合液。
      2. 看家基因引物设计用于扩增编码DNA旋转酶B的细菌基因内的DNA片段（7）。
   2. 对于每次qPCR反应，将每次反应中提取的100 μg DNA（10.5 μL）与14.5 μL qPCR主混合液混合。
   3. 使用qPCR仪及表1所列的热循环程序，对六次反应中的氨苄青霉素抗性基因和看家基因进行扩增检测。
   4. 根据qPCR生成的Cq值计算氨苄青霉素抗性基因的标准化转导效率（图3），以确认氨苄青霉素抗性基因的成功转导。
      1. Cq值（即循环定量值）是指样品信号首次超过背景阈值时所对应的最早PCR循环数。较低的Cq值表示目标序列含量较高，反之亦然。
      2. 可通过Cq值计算样品中目标基因的标准化转导效率，方法是用目标基因的Cq值减去看家基因的Cq值，得到ΔCq值，再通过公式2^(-ΔCq)计算标准化转导效率。

表1：qPCR热循环程序