cDNA末端快速扩增

1. 3’ RACE 实验设置

1. 为感兴趣的基因设计一个5’端特异性引物（基因特异性引物1，GSP-1）。该引物必须具有高度特异性，因为它是唯一引入特异性的引物。因此，建议使用相对较长的引物（通常长度约为24个核苷酸，Tm值范围为55–65 °C）。˚C）。 
2. 设计第二对嵌套引物（GSP-2），即该引物应位于 GSP-1 的 3’ 端下游。此步骤为可选，但使用嵌套引物进行第二轮 PCR 可提高目标基因扩增的产量和特异性。用于扩增 dSmad2 cDNA 的引物列于表 2 中。

2. cDNA 的合成 

1. 使用RNA提取方法或试剂盒，按照制造商提供的方案从样品中提取RNA。对样品进行DNase处理，以避免基因组DNA的扩增。在本示例中，我们从10只完整的成年果蝇中提取了RNA。
2. 使用微量分光光度计测定RNA浓度，必要时用无RNase的水调整至最高浓度为100 ng/μl。
3. 使用推荐用于RACE的试剂盒进行反转录（RT）反应以制备cDNA。为每个样品配制如下试剂的主混合液：
   - 4   μl  反转录缓冲液（5x）
   - 2   μl  Oligo(dT)₂₀ 引物（由20个脱氧胸苷组成的寡核苷酸）
   - 10 μl  RNA（最多1 μg）
   - 3   μl  ddH₂O
   - 1   μl  反转录酶 
   - 总体积：20 μl
4. 在42ºC下孵育反应体系90分钟。设置不含反转录酶的阴性对照。
5. 在85ºC下孵育5分钟以灭活反转录酶。
6. 为了稀释DNA浓度以提高PCR效率，加入80 μl TE缓冲液，使总体积达到100 μl。

3. cDNA 片段的扩增

1. 使用高保真（HF）Taq DNA 聚合酶配制第一轮扩增 PCR 反应体系：
   - 4      μl  5x HF Taq 聚合酶缓冲液
   - 0.4   μl  dNTP 混合物（各 10 mM）
   - 1      μl  GSP1 引物（10 μM）
   - 1      μl  Oligo(dT)20 引物（10 μM）
   - 1      μl  cDNA 模板
   - 0.2   μl  HF Taq DNA 聚合酶
   - 12.4 μl  ddH2O
   - 总体积：20 μl
2. 使用 PCR1 程序（表 1）进行 PCR 扩增。设置阴性对照，以未经逆转录的原始 RNA 产物作为模板。此外，可增设“无引物”对照。
3. 可选：进行巢式 PCR 以提高特异性和 cDNA 产物量。将 1 μl 第一轮 PCR 产物及阴性对照用 TE 缓冲液稀释 1:20，作为第二轮 PCR 的模板：
   - 4      μl  5x HF Taq 聚合酶缓冲液
   - 0.4   μl  dNTP 混合物（各 10 mM）
   - 1      μl  GSP2 引物（10 μM）
   - 1      μl  Oligo(dT)₂₀ 引物（10 μM）
   - 1      μl  第一轮 PCR 产物模板
   - 0.2   μl  HF Taq DNA 聚合酶
   - 12.4 μl  ddH2O
   - 总体积：20 μl
4. 使用 PCR2 程序（表 1）进行第二轮 PCR 扩增

4. cDNA 片段的分离

1. 用TAE缓冲液配制1-2%琼脂糖凝胶，并加入溴化乙锭或其他DNA染料。 
2. 将5 μl样品与1 μl 6x凝胶上样缓冲液混合。
3. 上样样品及1kb DNA Marker，在120 V电压下电泳约45分钟，或直至染料前沿迁移至凝胶约75%位置。注意避免样品跑出凝胶。
4. 在紫外灯下观察凝胶条带。如需对产物进行后续处理，应使用低强度紫外光，定位扩增条带后用手术刀将其从凝胶中切下。
5. 采用冻挤法或试剂盒等方法从凝胶中纯化DNA。
6. 将纯化的cDNA片段于-20ºC保存，或立即用于后续实验，如测序或克隆。