果蝇神经肌肉接头 （NMJ） 定量:一种评估突触形态和功能的方法

- 首先，用突出 NMJ 或神经肌肉接头不同方面的标志物对果蝇幼虫进行免疫染色。这是运动神经元轴突末端与肌肉接触的区域，其形态用作突触功能的读数。

轴突终止于几个分支，形成称为钮扣的凸起。神经递质从钮扣中释放并引起肌肉收缩。神经递质释放的区域称为活动区。这里一个标志物对勾勒出 NMJ 的突触蛋白具有特异性，另一个标志物对存在于活性区的蛋白质具有特异性。

接下来，使用显微镜获取 NMJ 图像，并使用半自动图像分析软件定量评估其形态。将一系列预设的软件命令应用于图像。输出文件包含分析的 NMJ 图像和形态学结果。可以测量的特征包括钮扣的数量和表面积、NMJ 长度和分支数量、未连接的 NMJ 隔室的数量以及活动区的数量。

在以下示例中，我们将分析用突触后标志物 DLG1 和活性区标志物 BRP 染色的果蝇 NMJ 的形态。

- 对于此协议，生成 NMJ 的图像堆栈并将它们保存为单独的 TIFF 文件，其中通道 1 显示 DLG1 染色或类似标记物，通道 2 显示 BRP 染色。首先，创建 NMJ 图像文件的 Z 投影和超堆栈。打开插件选项并选择 Drosophila NMJ morphometrics。

现在，确定显微镜在将图像系列存储为 TIFF 时分配给图像系列的唯一文件字符串。这将位于映像名称的末尾。将给定给最低平面和通道编号的字符串复制并粘贴到唯一的文件字符串设置窗口中。然后选择子宏"Convert to stack"并选择图像所在的目录或文件夹。

对于每个图像文件，将使用默认名称 stack 和 flat stack 创建两个新文件，后跟原始图像名称。然后可以删除原始文件以节省存储空间。接下来，从 Drosophila NMJ 形态计量学界面中，选择定义的 ROI 子宏并选择图像文件目录。

当第一个投影打开时，选择手绘选择工具，然后使用鼠标定义包含感兴趣的完整 NMJ 终端的区域。选择后，在定义的终端窗口中单击 OK。继续执行此作，直到在所有投影中定义 NMJ 终端。宏会自动推进该过程。对于每个图像文件，将创建一个新文件，其默认名称为 ROI，后跟原始图像名称。

要量化 NMJ 特征，首先转到 Drosophila NMJ 形态计量学界面并设置比例。例如，如果图像的一个像素对应于 0.72 微米，请将缩放像素设置为 1，将缩放距离设置为 0.072。然后选择子宏 Analyze，如果有两个通道图像，则同时切换 Wait。按 OK，并在出现提示时选择图像文件目录。每个突触的处理时间可能为几分钟。

分析后，每个分析突触的新图像文件都存储在父文件夹中，定量测量值results.txt文件中。检查所有图像并排除具有分割错误的图片。

例如，突触末端的某些部分可能不包含在黄色轮廓中。部分背景可能包含在突触末梢。蓝色骨架线可能延伸到突触末梢之外。活动区域可能过多，或者某些活动区域可能仍未被检测到。