球体形成实验：一种用于鉴定胰腺癌干细胞及筛选治疗方案的体外方法

— 胰腺导管腺癌（PDAC）包含一类具有专一成瘤能力的肿瘤干细胞（CSC）。CSC具有自我更新能力、多能性，并能形成肿瘤。它们表达抗凋亡蛋白，且含有多种耐药基因，因而对化疗具有抵抗性。为了鉴定肿瘤干细胞并研究药物对其作用，我们进行肿瘤球形成实验。

首先，将提取的肿瘤干细胞悬浮于所需细胞培养基中。接着，将细胞悬液接种至多孔板中，并在所需时间内进行培养。向部分孔中加入适量的待研究药物，其他孔中加入安慰剂作为阴性对照。将细胞继续培养至所需时间。在非黏附性培养环境下，肿瘤干细胞会形成球形的细胞集落。

孵育后，取少量细胞悬液移至血细胞计数板，并将其放入自动细胞计数仪中。随后计数形成的细胞球数量。经药物处理的细胞通常在细胞球的大小和数量上均表现出显著减少。在以下实验方案中，我们将进行细胞球形成实验，以鉴定胰腺癌干细胞并评估二甲双胍的作用。

为促进肿瘤球的形成以富集肿瘤干细胞，将细胞用适量的肿瘤干细胞培养基稀释至终浓度为每毫升2 × 10³个细胞，并在冰上预冷数分钟。随后，在24孔超低吸附细胞培养板的第一行和最后一行各加入500 µL PBS，用移液器吹打重悬细胞，每孔接种1 mL细胞悬液至板中未使用的孔内。

用待测药物处理四孔细胞，同时用溶剂处理至少四孔作为阴性对照。然后将细胞在37°C、5%二氧化碳条件下培养一周。每隔一天，向每孔中加入新鲜的药物处理液或溶剂。

在第5天或第7天，使用能够识别较大结构的自动细胞计数仪评估形成的肿瘤球数量。如需对肿瘤球进行连续传代，在第7天使用40微米细胞筛网收集肿瘤球。随后离心沉淀肿瘤球，并在37摄氏度下用1毫升胰蛋白酶孵育20分钟，使细胞团解离为单细胞悬液。然后按照上述方法将细胞再扩增7天。