球体形成检测:一种识别胰腺癌干细胞和筛选疗法的体外方法

- 胰腺导管腺癌 （PDAC） 包含专门致瘤的癌症干细胞 （CSC） 的子集。CSCs 具有自我可再生、多能性，并且能够形成肿瘤。它们表达抗凋亡蛋白，还包含多重耐药基因，使其对化疗具有耐药性。为了识别癌症干细胞并研究药物对它们的影响，我们进行了球体形成试验。

首先，将提取的癌症干细胞悬浮在所需的细胞培养基中。接下来，将细胞悬液接种到多孔板中，并孵育所需的持续时间。将所需量的目标药物加入几个孔中，并在其他孔中加入安慰剂作为阴性对照。将细胞孵育所需的持续时间。癌症干细胞在非贴壁培养环境中形成球形集落。

孵育后，将少量细胞悬液移液到血细胞计数器上，并将其放入自动细胞计数仪中。现在，计算形成的球体数量。药物处理的细胞通常显示球体的大小和数量显着减少。在以下方案中，我们将进行球体形成测定以识别胰腺癌干细胞并评估二甲双胍的效果。

- 为了促进肿瘤球体的形成以富集癌症干细胞，在适当体积的癌症干细胞培养基中将细胞稀释至终浓度为 2 乘以 10 至每毫升 3 个细胞，并在冰上冷却几分钟。然后，在 24 个超低附着细胞板的第一行和最后一行加入 500 微升 PBS 后，用移液管重悬细胞，并将每孔 1 毫升细胞接种到板的空孔中。

用目标药物处理四个细胞孔，用载体处理至少四个阴性对照孔。然后将细胞在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳下孵育一周。每隔一天，向每个井中添加新鲜的处理剂或载体。

在第 5 天或第 7 天，使用自动细胞计数器评估已形成的肿瘤球体的数量，从而可以识别更大的结构。对于肿瘤球的连续传代，在第 7 天，使用 40 微米细胞过滤器收获球体。接下来，将球体旋转下来，在 1 毫升胰蛋白酶中于 37 摄氏度孵育 20 分钟，以将沉淀解离成单细胞悬液。然后，如刚才所示，将细胞再扩增 7 天。