基于锌指核酸酶的基因组编辑：利用双链同源依赖性修复机制在人类多能干细胞中修饰基因组的技术

锌指核酸酶（ZFN）包含一个由锌离子稳定、可结合 DNA 的大分子结构域，该结构域通过连接肽与一个内切酶结构域相连。这种结构有助于在切割 DNA 时维持特异性。

为了使用锌指核酸酶（ZFNs）进行基因组编辑，取一培养物的人类多能干细胞，加入编码ZFN的质粒，并添加一个修复质粒，该质粒包含位于同源臂（HAs）之间的目标基因和抗生素抗性基因。将细胞与DNA的混合物进行电穿孔处理，通过电流促进质粒进入细胞内。

进入细胞后，翻译出的ZFN中的锌指结构域会结合宿主基因组中互补的三联碱基对，从而将Fok-1限制性内切酶精确定位于靶位点。ZFN成对结合在相反的DNA链上，促使Fok-1形成同源二聚体，构成具有活性的催化中心，由Fok-1在DNA上产生双链断裂（DSBs），并形成一个四核苷酸突出端。

修复质粒中的同源臂（HAs）可引导依赖同源性的修复过程，其中突出末端发生倒位，并以同源的HA序列作为模板。DNA合成通过添加与靶基因互补的核苷酸而继续进行。

随后的缺口通过连接反应得以闭合，从而促进基因插入。此外，无启动子的抗生素抗性基因可由插入位点上游的宿主启动子驱动表达。成功编辑的细胞能够在含抗生素的选择培养基中生长。

首先，在含有经丝裂霉素C灭活的小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）饲养层的6孔板中，于明胶包被的培养皿上用hESC培养基培养人多能干细胞。自接种后每一天，直至hPSC达到50%融合度，均使用玻璃移液管和真空装置吸除每孔中的全部培养基，并更换为每孔3毫升预温的hESC培养基。

靶向前一天，移除hESC培养基，并加入新鲜预热的、添加10微摩尔Y27632的hESC培养基。同时，从DR4小鼠制备一至两块含药物抗性MEF饲养层细胞的6孔板。在靶向当天，用移液器将5微克锌指核酸酶表达质粒1和质粒2分别加入1.5毫升离心管中，制备转染溶液。

加入30微克修复供体质粒，再加入足够量的1×磷酸盐缓冲液，使总体积达到300微升。在显微镜下观察细胞，确保细胞融合度达到50%。接着，使用玻璃移液管和真空装置将hPSC培养板中的培养基移除。然后，用2毫升预热的1×PBS洗涤细胞。吸除PBS后，直接向细胞中加入0.5毫升0.25%胰蛋白酶EDTA溶液。

将培养板放入组织培养孵育箱中约10分钟，或直至饲养层细胞开始从培养板表面脱离。孵育结束后，向每孔加入2毫升预热的esWash培养基以终止胰蛋白酶反应。收集每孔中的细胞，确保饲养层细胞以单层片状脱落。将所有孔中的内容物转移至一个50毫升的锥形离心管中，合并所有孔的细胞悬液，并使用10毫升血清移液管反复吹打重悬细胞。

加入esWash培养基，将细胞悬液调整至40毫升。静置1至2分钟，使较大的饲养层细胞团块沉降至管底，然后用血清移液管吸除上清液，并转移至新的50毫升锥形管中。将细胞悬液在190 × g条件下离心5分钟，随后小心吸除上清液，避免扰动细胞沉淀。用500微升1× PBS重悬细胞。

将重悬的细胞与先前配制的血浆转染溶液混合。用移液器将细胞和转染混合物加入4毫米电穿孔杯中，置于冰上孵育3至5分钟。将电穿孔系统的指数衰减程序参数设置为250伏、500微法、无限电阻和4毫米电穿孔杯规格。对细胞进行电穿孔处理，然后将电穿孔杯重新放回冰上孵育3分钟。

将电穿孔后的细胞重悬于18毫升添加了10微摩尔Y27632的预温hESC培养基中。在显微镜下检查DR4 MEFs。将3毫升单细胞悬液接种至含有DR4饲养层细胞的6孔板的每个孔中，然后放回培养箱。接种后第三天，用不含Y27632的hESC培养基更换细胞培养基。第四天，将未添加补充物的培养基更换为含有适当选择性抗生素的培养基。此处使用嘌呤霉素。