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锌指核酸酶或ZFN包含锌离子稳定的DNA结合宏结构域，通过连接子连接到核酸内切酶结构域。这种结构有助于在切割 DNA 时保持特异性。
要使用 ZFN 进行基因组编辑，请培养人类多能干细胞。用编码ZFN的质粒补充它。添加包含靶基因和夹在同源臂或HA之间的抗生素耐药基因的修复质粒。电穿孔细胞-DNA混合物，电流促进质粒进入细胞内。
一旦进入内部，翻译的 ZFN 的锌指基序就会与宿主基因组中互补碱基对的三联体结合，从而将 Fok-1 限制性核酸内切酶正确定位在靶位点。ZFN 成对与相反的链结合，使 Fok-1 同源二聚化形成活性催化中心，其中 Fok-1 产生 DNA 双链断裂或 DSB，产生四核苷酸突出端。
修复质粒中 HA 的存在指导同源依赖性修复，其中悬垂端倒置并使用同源 HA 序列作为模板。DNA 合成通过添加与靶基因互补的核苷酸继续进行。
由此产生的间隙被连接，促进基因插入。此外，无启动子抗生素耐药基因从插入位点上游的宿主启动子表达。成功编辑的细胞在抗生素选择培养基中生长。
首先在含有丝裂霉素 C 灭活小鼠胚胎成纤维细胞 （MEF） 的 6 孔板上的 hESC 培养基中培养人多能干细胞，该培养板在明胶上生长。接种后的每一天，直到hPSC达到50%汇合度，使用玻璃移液器和真空吸尘器去除全部体积的培养基。每孔更换3毫升温热的hESC培养基。
靶向前一天，取出hESC培养基，并加入补充有10微摩尔Y27632的新鲜预热hESC培养基。此外，从DR4小鼠中制备一到两个耐药MEF饲养细胞的6孔板。在靶向当天，通过将 5 微克锌指核酸酶表达质粒 1 和 2 移液到 1.5 毫升管中来制备转染溶液。
加入 30 微克修复供体质粒，然后加入足够的 1X 磷酸盐缓冲盐水，使体积达到 300 微升。在显微镜下检查细胞以确保 50% 的汇合度。接下来，使用玻璃移液器和真空吸尘器从 hPSC 板中取出培养基。然后，用 2 毫升温热的 1X PBS 洗涤细胞。吸出PBS后，将0.5毫升0.25%胰蛋白酶EDTA溶液直接添加到细胞上。
放入组织培养箱中约 10 分钟，或直到进料层开始从板上提起。孵育后，向每个孔中加入 2 毫升温热的 esWash 培养基以停止胰蛋白酶反应。从每个孔中收集细胞，确保饲养细胞呈片状。将每个孔的内容物移液到单个 50 毫升锥形管中，将所有孔混合在一起，并使用 10 毫升血清移液器研磨细胞。
加入esWash培养基，使细胞悬液达到40毫升。等待一到两分钟，让大的喂食块沉淀在管底部，然后，使用血清移液器去除上清液，并沉积到新鲜的50毫升锥形管中。将细胞悬液以190×g离心五分钟后，吸出上清液而不干扰细胞沉淀。将细胞重悬于 500 微升 1X PBS 中。
将重悬的细胞与之前制备的血浆转染溶液混合。将细胞和转染混合物移液到4毫米电穿孔比色皿中，然后放在冰上三到五分钟。将电穿孔系统上的指数程序参数设置为 250 伏、500 微法拉、无限电阻和 4 毫米比色皿尺寸。使细胞电穿孔，然后将比色皿放回冰上三分钟。
将电穿孔细胞重悬于补充有10微摩尔Y27632的18毫升温热hESC培养基中。在显微镜下检查 DR4 MEF。将 3 毫升单细胞悬浮液接种到含有 DR4 饲养细胞的 6 孔板的每个孔中，然后返回培养箱。在铺板后的第三天，用不含 Y27632 的 hESC 培养基替换细胞上的培养基。在第 4 天，用含有适当选择抗生素的培养基替换未补充的培养基。这里使用嘌呤霉素。
