抗酒石酸盐酸性磷酸酶染色:一种检测含有 TRAP 酶的培养破骨细胞的体外技术

破骨细胞是在骨表面发现的大型圆顶形多核细胞。这些细胞含有许多富含抗酒石酸盐酸性磷酸酶或 TRAP 的细胞质颗粒，这是一种金属蛋白酶，从破骨细胞的褶皱边缘分泌到骨组织中。这种酶消化细胞外基质并溶解矿物质晶体，促进骨吸收。

要检测TRAP颗粒作为破骨细胞的细胞化学标志物，请取含有贴壁破骨细胞的培养皿。向细胞中加入TRAP染色溶液。该溶液包括底物 - 一种含磷酸盐的萘酚衍生物和酒石酸，在补充有重氮盐的缓冲液中。

乙酸添加到该溶液中以维持 TRAP 染色所需的酸性 pH 值。将细胞在生理温度下在黑暗中孵育，以获得最佳的 TRAP 酶活性。

染色液进入破骨细胞，酒石酸抑制其他细胞中酒石酸盐敏感酸性磷酸酶的水解活性。

同时，TRAP水解添加的底物以去除其磷酸基团。水解底物与染色溶液中的重氮盐偶联，形成栗色不溶性染料络合物。该复合物在酶活性位点以颗粒形式沉淀。

显微镜下对细胞进行成像。栗色染料颗粒在细胞质内的沉积证实了培养物中存在含有TRAP的破骨细胞。

在此步骤中，吸出培养基，并用 1X PBS 轻轻洗涤样品 3 次。接下来，在室温下用 100 微升固定溶液将细胞固定在 96 孔板的每个孔中 30 秒。

固定后，吸出固定液，用去离子水轻轻洗涤细胞3次，预热至37摄氏度。然后，吸出去离子水，并在 96 孔板的每个孔中加入 100 微升 TRAP 染色剂。

将板置于37摄氏度的培养箱中30分钟，并避光。染色后，吸出TRAP染色剂，用去离子水轻轻洗涤3次。随后，在倒置显微镜中以 40 倍放大倍率对破骨细胞进行成像。