抗酒石酸酸性磷酸酶染色：一种 体外 检测含TRAP酶培养破骨细胞的技术

破骨细胞是位于骨表面的大型、圆顶状、多核细胞。这些细胞含有大量富含抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）的胞质颗粒，TRAP是一种由破骨细胞皱褶缘分泌至骨组织中的金属蛋白酶。该酶可降解细胞外基质并溶解矿物晶体，从而促进骨吸收。

为了将TRAP颗粒作为破骨细胞的细胞化学标志物进行检测，取含有贴壁破骨细胞的培养皿。向细胞中加入TRAP染色液。该溶液包含底物——一种含磷酸基的萘酚衍生物和酒石酸，溶于缓冲液中，并添加重氮盐。

向该溶液中加入乙酸，以维持TRAP染色所需的酸性pH值。将细胞在生理温度下避光孵育，以获得最佳的TRAP酶活性。

染色液进入破骨细胞，其中的酒石酸可抑制其他细胞中对酒石酸敏感的酸性磷酸酶的水解活性。

与此同时，TRAP 会水解所添加的底物，去除其磷酸基团。水解后的底物与染色液中的重氮盐结合，形成红褐色的不溶性染料复合物。该复合物在酶活性位点处以颗粒状沉淀析出。

在显微镜下观察细胞。胞质内出现栗色染料颗粒沉积，表明培养物中存在含TRAP的破骨细胞。

在此步骤中，吸去培养基，并用 1× PBS 轻柔洗涤样品三次。接着，在室温下，每孔加入 100 µL 固定液，对 96 孔板的每个孔中的细胞固定 30 秒。

固定后，吸除固定液，用预热至 37 摄氏度的去离子水轻柔洗涤细胞三次。然后吸除去离子水，向 96 孔板的每个孔中加入 100 µL TRAP 染色液。

将培养板置于37摄氏度培养箱中孵育30分钟，并避光。染色完成后，吸除TRAP染液，用去离子水轻轻洗涤三次。随后，在倒置显微镜下以40倍放大倍数观察破骨细胞。