配体差异径向毛细管作用分析：一种高通量筛选细菌核苷酸第二信使结合蛋白的细胞内靶标蛋白技术

细菌在适当刺激下会产生核苷酸类第二信使（NSMs），即细胞内信号分子。这些分子可结合靶蛋白并调控细菌功能。

为了利用配体差异径向毛细管作用分析法鉴定这些靶蛋白，取含有可溶性蛋白质的多孔板，其中蛋白质来源于表达基因组中不同开放阅读框（ORFs）的各个细菌克隆，确保每个孔含有不同的蛋白质。

加入用放射性磷标记的鸟苷四磷酸和五磷酸混合物——即标记的NSMs。这些分子可与裂解液中的靶蛋白结合。使用点样针工具，从每个孔中吸取等量液体。将工具置于硝酸纤维素膜上，将液体以斑点形式点样。

靶蛋白通过非共价相互作用与膜结合，从而阻止其扩散。这使得结合的放射性标记NSMs被限制在施加点的中心位置。游离的NSMs则随液相呈放射状扩散。 通过 毛细作用

使用磷屏成像技术检测放射性信号，并获取斑点的数字图像。用两个圆圈定义斑点：外圈表示扩散的纳米材料（NSMs）的边缘，内圈代表被隔离的纳米材料（NSMs）。

计算结合率——内圈检测到的放射性强度与扩散斑点的总放射性强度之比。寻找结合率较高的斑点，以确定含有与NSM结合的目标蛋白的孔。

进行目标蛋白的 DRaCALA 筛选时，将 20 微升解冻的全细胞裂解液加入 96 孔 V 型底微孔板的各个孔中，并向每孔加入 2.5 单位的 Serratia marcescens 核酸内切酶。在 37 摄氏度孵育 15 分钟后，将裂解液置于冰上 20 分钟。

接下来，将等体积的磷-32标记的鸟苷五磷酸与鸟苷四磷酸混合，并向混合物中加入1倍体积的裂解缓冲液#1，以获得浓度为4纳摩尔的鸟苷五磷酸溶液。

使用多通道移液器和带滤芯的移液器吸头，将10微升鸟苷五磷酸混合物与细胞裂解液混合，在室温下孵育5分钟。

孵育结束后，将96孔针工具在0.01%的非离子去污剂溶液中清洗三次，每次30秒，每次清洗后在纸巾上干燥30秒，然后将针工具放入96孔样品板中。30秒后，垂直提起针工具，并将其垂直向下放置于硝酸纤维素膜上保持30秒。

干燥5分钟后，将硝酸纤维素膜放入透明塑料夹中，用于储存并进行磷屏曝光，通过磷光成像进行检测，操作如图所示。

为了在与磷屏成像仪配套的分析软件中定量并鉴定潜在的目标蛋白，请打开已显影平板的.gel文件。

为了确定待分析的点位，使用“阵列分析”功能设置一个12列×8行的网格。为圈定整个斑点的外缘，定义较大的圆。将所定义大圆的“体积+背景”和“面积”导出至电子表格，以圈定内部较小的点。缩小所定义圆的尺寸。

导出所定义小圆的“体积+背景”和“面积”，并将所有数据保存到电子表格中。根据需要调整圆的位置以与信号点重叠，并将其大小调整为略大于实际信号点。

使用该方程在电子表格中计算结合分数，并绘制数据。然后，鉴定那些结合分数明显高于大多数其他孔的孔中潜在的结合蛋白。