配体测定的差异径向毛细作用:一种鉴定细菌核苷酸第二信使结合细胞内蛋白的高通量技术

细菌产生核苷酸第二信使，即 NSM（细胞内信号分子）以响应适当的刺激。这些分子与靶蛋白结合并调节细菌功能。

要使用配体测定的差异径向毛细管作用来鉴定这些靶蛋白，请取含有可溶性蛋白质的细菌细胞裂解物的多孔板。这些蛋白质来源于基因组中表达单个 ORF（开放阅读框）的不同细菌克隆，确保每个孔都有不同的蛋白质。

添加鸟苷四磷酸盐和五磷酸盐的混合物 - 用放射性磷标记的 NSM。这些分子与裂解物中的靶蛋白结合。使用销钉工具，从每个孔中收集等量的液体。将工具放在硝化纤维素膜上，将液体沉积为斑点。

靶蛋白通过非共价相互作用与膜结合，阻止其扩散。这将结合的放射性标记的 NSM 隔离在应用的中心点。游离 NSM 通过毛细管作用与液相径向扩散。

使用荧光粉成像检测放射性信号并获得斑点的数字图像。使用两个圆圈定义点。外面的描绘了扩散的 NSM 的外围。内圈代表隔离的 NSM。

计算结合分数 - 从内圈检测到的放射性强度与扩散点的总放射性。定位具有高结合组分的点，以鉴定具有 NSM 结合靶蛋白的孔。

对于目标蛋白的DRaCALA筛选，将20微升解冻的全细胞裂解物添加到96孔V底微量滴定板的单个孔中，并向每个孔中加入2.5单位粘质沙雷氏菌核酸内切酶。在 37 摄氏度下 15 分钟后，将裂解物放在冰上 20 分钟。

接下来，混合等体积的磷32标记的鸟苷五磷酸盐和鸟苷四磷酸盐，并在混合物中加入1x裂解缓冲液#1，以获得四纳摩尔鸟苷五磷酸溶液。

使用多通道移液器和过滤的移液器吸头，将 10 微升鸟苷五磷酸混合物与细胞裂解物混合，在室温下孵育 5 分钟。

在孵育结束时，将 96X 针式工具在 0.01% 非离子洗涤剂溶液中洗涤 3 次，持续 30 秒，然后每次洗涤用纸巾干燥 30 秒，然后将针式工具放入 96 孔样品板中。30 秒后，将销钉工具笔直向上提起，然后将其笔直向下放在硝化纤维素膜上 30 秒。

干燥五分钟后，将硝酸纤维素膜放入透明塑料文件夹中，用于储存荧光粉屏幕曝光并通过荧光粉成像进行可视化，如图所示。

要在与荧光粉成像仪相关的分析软件中定量和识别潜在的靶蛋白，请打开可视化板的 .gel 文件。

要定义要分析的点，请使用"阵列分析"功能设置 12 列 x 8 行网格。要限制整个斑点的外边缘，请定义大圆圈。将定义的大圆圈的"体积+背景"和"面积"导出到电子表格中，以限制小的内部点。缩小定义的圆的大小。

导出定义的小圆圈的"体积+背景"和"面积"，并将所有数据保存在电子表格中。根据需要将圆圈定位为与点重叠，调整大小以略大于实际点。

使用该方程计算电子表格中的结合分数，并绘制数据。然后，确定孔中与大多数其他孔相比显示高结合分数的潜在结合蛋白。