线粒体钙摄取检测：一种基于酶标仪的分离线粒体钙摄取测量方法

线粒体摄取胞质钙离子，因为钙离子对其正常功能至关重要。

过量的钙离子流入线粒体基质——即线粒体钙超载——会触发线粒体内膜通道的开放，该通道称为线粒体通透性转换孔（mitochondrial permeability transition pore, MPTP）。通道开放后，线粒体钙离子外流增加，导致线粒体功能障碍。

为测量线粒体钙离子摄取，首先准备一个含分离线粒体的多孔板，线粒体悬浮于适当的缓冲液中。向孔中添加丙酮酸和苹果酸，二者均为产生ATP的底物。混匀孔内成分后进行孵育。

孵育过程中，丙酮酸和苹果酸被转化为ATP，为线粒体提供能量。加入含有线粒体膜不可渗透的钙离子敏感型荧光染料分子的溶液。将含钙缓冲液加入已获得能量的线粒体中。

监测染料分子与缓冲液中游离钙结合时的钙荧光。

加入更多钙离子以启动线粒体钙内流。线粒体内钙离子逐渐增加，导致缓冲液中的钙离子减少，从而降低染料的钙荧光信号。

当线粒体达到其最大钙承载能力后，继续添加钙离子会开启线粒体通透性转换孔（MPTP）通道，使钙进入缓冲液。缓冲液中的钙与染料分子结合，导致染料-钙复合物的荧光增强。

通过在不同时间点添加钙离子，绘制染料荧光变化，以监测线粒体钙离子摄取的动力学过程。

使用酶标仪开始线粒体钙离子摄取测量时，设置酶标仪每秒进行一次钙绿-5N荧光的动态读数，总时长为1,000秒。

在不同时间点，将试剂注射器设置为每次注入 5 微升氯化钙溶液。然后，使用将要使用的氯化钙溶液对注射器进行预灌注。

接下来，将200微克分离的线粒体加入96孔板的一个孔中，并加入适量的氯化钾缓冲液，使总体积达到197微升。然后，依次加入1微升1摩尔的丙酮酸盐溶液、1微升500毫摩尔的苹果酸溶液和1微升1毫摩尔的钙绿-5N储备液，用移液器轻轻混匀。

避光、室温孵育2分钟，使线粒体充分活化。最后，启动预设的动力学程序，监测钙绿-5N的荧光信号。