线粒体钙摄取测定:一种基于读板器的测量离体线粒体钙摄取的方法

吸收胞质钙，因为它对其正常运作至关重要。

过量的钙流入线粒体基质（线粒体钙过载）会触发内膜通道、线粒体通透性过渡孔或 MPTP 的打开。打开的孔隙增加了线粒体的钙流出，导致线粒体功能障碍。

要测量线粒体钙摄取，请从悬浮在合适缓冲液中的含有分离线粒体的多孔板开始。用丙酮酸和苹果酸补充孔，它们是产生 ATP 的底物。混合孔中的内容物，然后孵育。

孵育过程中，丙酮酸和苹果酸转化为 ATP，为线粒体注入活力。加入含有线粒体膜不渗透、钙敏感荧光染料分子的溶液。将含钙缓冲液分配到通电的线粒体中。

染料分子与缓冲液中的游离钙结合时，监测染料的钙荧光。

添加更多钙离子以启动线粒体钙流入。逐渐增加的线粒体钙减少缓冲液中的钙离子，从而降低染料的钙荧光。

一旦线粒体达到其最大钙携带能力，进一步添加钙离子就会打开MPTP通道并将钙导入缓冲液中。缓冲钙与染料分子结合，导致染料钙荧光增加。

钙添加不同时间点的染料荧光图，以监测线粒体钙摄取的动力学。

要使用酶标仪开始测量线粒体钙摄取，请对读标仪进行编程，使其每秒执行钙绿-5N荧光的动力学读数，总时间为1,000秒。

试剂进样器进行编程，使其在不同时间点分配 5 微升氯化钙溶液。然后，用将使用的氯化钙溶液灌注注射器。

接下来，将 200 微克分离的线粒体添加到 96 孔板的一个孔中，并加入适当体积的氯化钾缓冲液，以达到 197 微升的总体积。然后，加入 1 微升 1 摩尔丙酮酸盐、1 微升 500 毫摩尔苹果酸盐和 1 微升 1 毫摩尔钙绿-5N 储备液，并通过移液轻轻混合。

室温下避光孵育2分钟，使线粒体充满活力。最后，启动预编程动力学方案，并监测钙绿-5N荧光。