通过结肠组织切片的免疫组织化学分析评估化学诱导性结肠炎

在小鼠中，结肠黏膜层由含有固有层的免疫细胞组成，外层为紧密排列的上皮，可保护黏膜。使用葡聚糖硫酸钠进行化学处理会破坏紧密连接，导致上皮细胞损伤，并使管腔微生物侵入固有层。

结肠中的微生物识别会触发趋化因子的分泌，导致免疫细胞浸润以及促炎性细胞因子的释放。这种过度的免疫反应可引发结肠炎症或结肠炎。

为评估化学诱导的结肠炎，首先准备载有经固定和预处理的小鼠结肠组织切片的玻片，该切片应显示化学诱导的结肠炎病变。将切片与针对免疫细胞受体的多种特异性一抗混合物共同孵育，这些抗体会与其相应的免疫细胞结合。

洗涤以去除未结合的抗体。将组织切片与生物素标记的二抗孵育，二抗可特异性结合一抗。再与链霉亲和素-酶结合物孵育，后者与生物素相互作用，形成复合物。

在组织切片上覆盖一种显色底物；酶与底物的相互作用会使免疫细胞呈现棕褐色。用苏木精染料对切片进行复染，以染色细胞核。

在显微镜下观察染色后的切片。损伤区域中大量存在的棕色免疫细胞表明化学诱导的结肠炎。

进行免疫组织化学分析时，先将切片在加热板上温育20分钟，然后用PBS洗涤载玻片三次，每次10分钟，并用3%过氧化氢孵育10分钟以消除内源性过氧化物酶活性。

孵育结束后，如所示用 PBS 洗涤样本三次，并在室温下用封闭缓冲液封闭非特异性结合位点，封闭时间至少为一小时。随后，将封闭缓冲液替换为含目标一抗混合液的溶液，在 4 摄氏度下孵育过夜。

第二天早上，吸去多余的初级抗体溶液，用 PBS 洗涤切片三次。最后一次洗涤后，在室温下用相应的生物素化次级抗体混合液孵育切片，随后用链霉亲和素-辣根过氧化物酶复合物进行标记。

为了观察免疫反应性细胞，使用DAB对样本进行染色，直至出现浅棕色或深棕色，然后用苏木精和0.3%稀释氨水对切片进行复染。

切片干燥后，使用光学显微镜在10倍放大倍数下获取组织切片的明场图像，并利用图像处理软件识别并定量上皮层和固有层中标记的免疫细胞群体。