一种用于研究T细胞与支撑性平面脂双层相互作用的体外技术

取一个含有支撑脂质双层（SLB）的流动小室。

SLB 与特定配体——细胞间黏附分子 1（ICAM-1）和抗 CD3 抗体——偶联，并用荧光染料进行标记。

加入T细胞和荧光标记的抗CD107a Fab片段——即针对脱颗粒标志物的抗体的抗原结合片段。

T细胞受体-CD3（TCR-CD3）复合物与抗CD3抗体结合，从而激活TCR。

由触发诱导的由内向外信号转导可激活细胞表面的整合素，使其与固定的ICAM-1结合。

偶联诱导细胞骨架重排——微管重新排列以及肌动蛋白聚合，从而导致细胞在支持性脂双层（SLB）表面发生侧向铺展。

扩散使得更多的配体-受体相互作用得以形成超分子活化簇（SMAC），从而构建免疫突触。

T细胞的溶细胞颗粒沿微管移动并与质膜融合，使细胞表面暴露脱颗粒标志物，这些标志物可与抗CD107a Fab结合。

使用荧光显微镜观察富含 TCR-CD3 复合物、整合素和脱颗粒标志物的免疫突触。

首先使用聚丙烯剪式镊子将玻璃盖玻片浸入新配制的酸性piranha溶液中，处理25至30分钟。清洗结束后，每次用新鲜的超纯水冲洗盖玻片，共冲洗七次，每次均使用新鲜体积的超纯水。将湿润的盖玻片放置一旁，使残留的水分从洁净的玻璃表面自然流下。

当盖玻片干燥后，在无菌通风橱中，精确地将两微升最终脂质体混合物加到自粘载玻片通道的中央，立即小心地将一片洁净干燥的盖玻片与载玻片对齐，使其轻轻降落在载玻片的粘性面上，并使用聚丙烯剪刀形镊子的外圈对盖玻片与载玻片接触的边缘施加轻柔压力，确保盖玻片紧密贴附于载玻片，防止泄漏。然后，将载玻片翻转过来，用永久性记号笔在载玻片组件外侧围绕双层膜画四个点。

在首次注射前，将通道的一个端口指定为入口端口，另一个端口指定为出口端口，并在整个实验过程中保持该设定。为避免气泡形成，将移液器吸头末端直接插入入口端口，直至感觉到吸头刺穿载玻片通道的橡胶密封。

缓慢地用 50 微升预热的检测缓冲液填充通道。向入口端注入 200 微升含酪蛋白阻断液的氯化镍(II)溶液，并从出口端移除 50 微升缓冲液。孵育 45 分钟后，从出口端去除多余的酪蛋白溶液。

向入口注入100微升ICAM-1和链霉亲和素溶液，在室温下孵育45分钟。孵育结束后，从出口去除多余的蛋白溶液，并用100微升检测缓冲液洗涤双层膜两次，每次洗涤重复一次。然后，加入100微升荧光染料标记的抗CD3抗体溶液，在室温下标记45分钟，随后按照上述方法，每次用100微升检测缓冲液洗涤两次。

为了成像T细胞与双层膜的相互作用，将载玻片置于全内反射荧光（TIRF）显微镜的37摄氏度加热载物台上，并利用墨水标记调整载物台位置，使双层膜位于100倍物镜的中心。

进行颗粒释放成像时，将荧光标记的抗CD107a抗体Fab片段加入CD4 T细胞悬液中，将标记后的细胞重悬于50 µL检测缓冲液中，用于注入载玻片通道的进样口。随后，选择适当数量的实验视野，自注入后每分钟采集一次各视野的图像，持续记录30分钟。