一种研究 T 细胞与支持的平面脂质双层相互作用的体外技术

取含有支撑脂质双层或 SLB 的流动载玻片。

SLB 与用荧光团标记的特定配体（细胞间粘附分子 1 或 ICAM-1 和抗 CD3 抗体）偶联

加入 T 细胞和荧光团标记的抗 CD107a Fab — 针对脱颗粒标记物的抗体的抗原结合片段。

T 细胞受体-CD3 或 TCR-CD3 复合物与抗 CD3 抗体结合，触发 TCR。

触发诱导的由内而外的信号传导激活表面的整合素，与固定的ICAM-1结合。

偶联诱导细胞骨架重组——微管重排和肌动蛋白聚合，导致细胞在 SLB 表面横向扩散。

扩散允许更多的配体-受体相互作用形成超分子激活簇或 SMAC，从而产生免疫突触。

T细胞裂解颗粒沿着微管移动并与质膜融合，暴露细胞表面的脱颗粒标志物，这些标志物与抗CD107a Fab结合。

使用荧光显微镜，观察富含 TCR-CD3 复合物、整合素和脱颗粒标记物的免疫突触。

首先使用聚丙烯剪刀式镊子将玻璃盖玻片浸入新鲜制备的酸性食人鱼溶液中 25 至 30 分钟。洗完后，每次洗用新鲜的超纯水冲洗盖玻片七次，然后将湿盖玻片放在一边，让剩余的水从干净的玻璃杯上滚落。

盖玻片干燥时，将两微升最终脂质体混合物精确地等分在无菌流罩内的自粘载玻片通道的中心，并立即但小心地将一个干净干燥的盖玻片与载玻片对齐，以使盖玻片轻轻降低到载玻片的粘性侧，并使用聚丙烯剪刀式镊子的外圈对外周接触施加轻柔的压力盖玻片与载玻片一起，确保载玻片紧紧贴在载玻片上，以防止泄漏。然后，将载玻片翻过来，并使用永久性记号笔在载玻片组件外侧的双层周围画四个点。

第一次进样之前，将通道的一个端口指定为入口端口，另一个端口作为出口，在整个实验过程中保持此名称。为避免气泡形成，请将移液器吸头的末端直接插入入口，直到您感觉到滑动通道的橡胶密封件被吸头穿透。

慢慢地，用 50 微升温测定缓冲液填充通道。将 200 微升酪蛋白封闭溶液中的氯化镍 （II） 注入入口端口，并从出口中取出 50 微升缓冲液。孵育 45 分钟后，从出口中取出多余的酪蛋白溶液。

100 微升 ICAM-1 和链霉亲和素溶液注入入口端口，在室温下孵育 45 分钟。在孵育结束时，从出口中取出多余的蛋白质溶液，每次洗涤用 100 微升测定缓冲液洗涤双层两次。然后，在室温下用 100 微升荧光团偶联的抗 CD3 抗体标记双层 45 分钟，然后每次洗涤在 100 微升测定缓冲液中洗涤两次，如图所示。

要对 T 细胞-双层相互作用进行成像，请将载玻片放在全内反射荧光 （TIRF） 显微镜的 37 摄氏度加热载物台上，并使用墨水标记调整载物台，使双层居中到 100 度物镜上。

对于颗粒释放成像，将荧光偶联的抗CD107a抗体Fab片段加入CD4 T细胞悬液中，并将标记的细胞重悬于50微升测定缓冲液中，用于注射到载玻片通道的入口中。然后，选择适当数量的实验区域，并在注射后30分钟内每分钟记录一次每个区域的图像。