0 次观看 • 2:59 分钟 • July 8th, 2025
取固定并通透化的冠状病毒感染的Vero细胞——一种缺乏干扰素的哺乳动物细胞系。
在宿主细胞内,病毒RNA以亚基因组RNA(sgRNA)的形式存在,这些中等长度的RNA分子编码特定的病毒蛋白,由宿主细胞合成 通过 转录
加入杂交链式反应(HCR)引发探针。
HCR探针与其靶RNA上的互补序列结合。
引入荧光标记的寡核苷酸发夹探针 H-1 和 H-2。
引发探针与其互补的H1尾部结合,使发夹结构线性化。
暴露的H1序列与互补的H2尾部结合。
尾随的H2序列继续与H1尾部结合,在目标区域周围扩增荧光标记探针,从而产生强烈的信号。
加入适当的抗体以可视化宿主细胞的细胞骨架。
使用 DAPI 对细胞核进行染色。
在荧光显微镜下,病毒感染的细胞在细胞质中显示红色荧光,表明存在目标RNA。
按照文稿中所述固定并通透细胞后,从孔中移除1x PBS溶液,并向每孔中加入至少300微升扩增缓冲液。将样品在室温下孵育30分钟。通过在独立的离心管中对所需体积的HCR发卡探针进行快速冷却来分别制备每种HCR发卡探针。
配制300微升扩增溶液时,每种发夹结构使用18皮摩尔。将发夹溶液转移至离心管中,在95摄氏度孵育90秒,随后在避光条件下冷却至室温,持续30分钟。通过将快速冷却的H1和H2发夹结构加入扩增缓冲液中,制备发夹混合物。将30至50微升的发夹混合物滴加到Parafilm上,并在室温下避光孵育过夜。
封片时,在载玻片上放置两滴10微升的封片剂,确保两滴之间留有足够间距,以便在同一张载玻片上放置两个盖玻片。用干净的纸巾轻压盖玻片以去除多余液体。然后将盖玻片细胞面朝下置于抗荧光淬灭封片剂中。将封好的样品置于干燥平坦的表面,避光静置使其固化。
本文介绍了一种利用杂交链式反应(HCR)检测冠状病毒感染Vero细胞中病毒RNA的方法。该技术采用荧光标记的探针来扩增信号,以便在荧光显微镜下进行观察。
结合免疫荧光的杂交链式反应-荧光原位杂交(HCR-FISH)可实现对感染细胞中SARS-CoV-2亚基因组RNA的空间分辨检测,有助于宿主-病毒相互作用机制的研究。该方法通过提供病毒RNA定位的定量性、单细胞分辨率数据,增强了早期发现的预测可信度。该技术适用于传染病研究流程中的项目筛选与靶点验证。
该方法通过实现假设验证、定量检测以及抗病毒研究的即用型检测,融入从发现到临床前研究的连续过程。
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最后更新:22 八月 2026