使用 Immuno-RNA 荧光原位杂交可视化 SARS-CoV-2

取固定和透化的冠状病毒感染的 Vero 细胞——一种缺乏干扰素的哺乳动物细胞系。

宿主体内，病毒 RNA 以亚基因组或 sgRNA 的形式存在，这些 RNA 分子编码通过转录合成的特定病毒蛋白

添加杂交链反应或HCR引发剂探针。

HCR 探针与其在靶 RNA 上的互补序列结合。

引入荧光标记的寡核苷酸发夹探针 H-1 和 H-2。

引发剂探针与其互补的 H1 尾部结合，使发夹结构线性化。

暴露的 H1 序列与其互补的 H2 尾部结合。

尾随的 H2 序列继续与 H1 尾部结合，放大目标区域周围的荧光标记探针，并产生稳健的信号。

添加适当的抗体以可视化宿主细胞细胞骨架。

使用 DAPI 对细胞核进行染色。

在荧光显微镜下，病毒感染的细胞在细胞质中显示红色荧光，表明目标 RNA 的存在。

和透化细胞后，如文本手稿中所述，从孔中取出 1x PBS 溶液，并向每个孔中加入至少 300 微升扩增缓冲液。将样品在室温下孵育 30 分钟。通过在单独的管中快速冷却所需体积来制备每个 HCR 发夹。

要制备 300 微升扩增溶液，请使用每个发夹的 18 匹卡摩尔。将发夹溶液转移到试管中，并在 95 摄氏度下孵育 90 秒。然后，在黑暗中冷却至室温 30 分钟。通过将快速冷却的 H1 和 H2 发夹添加到扩增缓冲液中来制备发夹混合物。将 30 至 50 微升发夹混合物滴在封口膜上，并将样品在室温下在黑暗中孵育过夜。

要安装载玻片，请将两滴 10 微升的封固剂滴在载玻片上，确保液滴充分分离，以便将两个盖玻片放置在一张载玻片上。用干净的毛巾轻拍盖玻片，去除多余的液体。然后，将它们放入防褪色封片剂中，细胞朝下。将安装的样品放在黑暗中干燥的平面上，让它们固化。