通过病毒灭活实验评估抗病毒测试化合物的有效性

取含有编码分泌型荧光素酶报告基因RNA的重组丙型肝炎病毒（HCV）悬液管。

向测试管和阴性对照管中加入抗病毒测试化合物和溶剂。

测试化合物与丙型肝炎病毒糖蛋白结合，使病毒失活。

孵育后，稀释混合物以防止后续步骤中化合物与细胞的相互作用。

将这些稀释后的混合物加入支持HCV复制的肝癌细胞单层中。孵育。

经化合物灭活的HCV无法与特定的细胞表面受体结合，而具有活性的HCV糖蛋白则可与这些受体结合，从而促进病毒与细胞的黏附。

去除未吸附的HCV。用缓冲液洗涤并加入培养基。长时间孵育。

结合的HCV被内化，释放病毒RNA，导致病毒蛋白和荧光素酶的合成，并从细胞中分泌出来。

收集含有荧光素酶的培养上清液。离心后，向上清液中加入荧光素酶底物。

荧光素酶氧化底物，发出光。

对照孔中的发光强度高于检测孔，表明该化合物具有病毒灭活作用。

开始病毒灭活实验时，首先在96孔板中每孔接种1 × 10⁴个细胞。将细胞在37°C、5%二氧化碳条件下孵育过夜，以促进贴壁。进行感染时，制备文本方案中所引用的海肾荧光素酶报告基因标记的丙型肝炎病毒（HCV）颗粒。

在无菌离心管中，将 100 微升 100 微摩尔的 CHLA 或 PUG 与 100 微升 10⁴ 焦点形成单位（FFU）的 HCV 混合。作为阳性对照，将 HCV 与肝素混合，终浓度为 1,000 微克/毫升。在 37 摄氏度下孵育 3 小时。

3小时后，将病毒化合物混合物用9.8毫升室温基础培养基稀释50倍。然后，制备新的病毒化合物混合物，并立即用基础培养基稀释该混合物，用于零小时孵育样品。从细胞中移除孵育培养基后，每孔加入100微升稀释后的病毒药物溶液，设三个重复孔。

此时溶液中含有每孔10的二次方个感染单位（FFU）。在37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育3小时，以允许病毒感染细胞。孵育结束后，从孔中移除病毒悬液，并用200微升PBS轻轻洗涤细胞两次。

将细胞在 100 微升基础培养基中孵育 72 小时，以促进病毒复制及荧光素酶报告基因释放至培养上清液中。随后，收集培养物的上清液至微量离心管中，在 4 摄氏度下以 17,000 × g 离心 5 分钟，以去除细胞碎片。取每份上清液 20 微升与 50 微升海肾荧光素酶检测试剂混合，使用发光仪检测荧光素酶报告基因活性所产生的发光信号。