基于 TIRF 显微镜的吞噬体形成和闭合可视化

取一个聚合物涂层的玻璃底培养皿，其中含有粘附在其表面的 IgG 调理红细胞或红细胞。

培养皿放在全内反射荧光显微镜载物台上，将其保持在生理温度。

添加含有荧光标记的细胞质肽的巨噬细胞，这些肽与聚合肌动蛋白结合，促进细胞骨架可视化。

成像过程中，将激光束引导至大于临界角的角度，在接触点处引起内反射和倏逝波的产生。

倏逝波选择性地照亮玻璃-样品界面处的荧光团，从而实现吞噬作用的实时可视化。

巨噬细胞 Fc 受体与 IgG 调理红细胞结合，导致受体在接触区域周围聚集。

聚类触发细胞内信号通路和GTP酶激活，驱动肌动蛋白聚合和动力蛋白募集，形成假足。

伪足围绕红细胞延伸，形成吞噬杯。

最终，伪足尖端融合在一起。积累的动力蛋白介导吞噬体与细胞膜的分离，使调理的红细胞内化。

对于SRBC的非共价固定，将2毫升IgG调理细胞倒入每个聚赖氨酸包被的培养皿中，并在摆动转子离心机中离心样品。弃去上清液，并用2毫升PBS加10%BSA洗涤颗粒一次。

然后，将颗粒与 2 毫升新鲜 PBS 加 10% BSA 在室温下孵育 30 分钟，然后用 2 毫升 PBS 洗涤 3 次。最后一次洗涤后，用 2 毫升 37 摄氏度无血清显微镜培养基替换 PBS。

将SRBC编码的培养皿放在显微镜载物台上。然后，从培养皿底部刮出转染的目标细胞，并移液细胞几次以获得单细胞悬浮液。将转染的细胞加入SRBC包被的培养皿中。

启动实时采集软件。找到表达荧光标记蛋白的细胞并调整培养皿的位置，使感兴趣的细胞位于视场的中间。在一个激发波长下以 0.01 度的增量采集 500 到 0 度的不同角度的图像。

要确定入射光在玻璃-介质界面处完全反射并产生倏逝波的临界角，请在适当的成像软件中打开图像序列。选择细胞中具有均匀荧光的感兴趣区域。

然后，在"图像"选项卡下，选择"堆栈"并绘制 Z 轴轮廓。绘制在感兴趣区域测量的 Z 轴轮廓平均荧光强度，并使用 X 轴上角度的函数。然后，在显微镜检查期间，可以使用 x 轴上任何高于临界角的角度值来获得 TIRF 信号。