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神经科学
0 次观看 • 3:13 分钟 • July 8th, 2025
在含培养基的多孔板中培养原代小鼠胚胎多巴胺能神经元的微岛培养物。
这些神经元经预先形成的纤维（PFFs）处理——即α-突触核蛋白的错误折叠和聚集形式。
原纤维片段（PFFs）作为“种子”，可触发内源性α-突触核蛋白的进一步错误折叠和寡聚化，形成磷酸化的α-突触核蛋白纤维，这些纤维最终聚集成路易小体。
用固定剂替换培养基，以保存细胞形态。
用缓冲液洗涤细胞。
加入含有去污剂的缓冲液以通透细胞膜。
加入封闭液以防止非特异性抗体结合。
加入靶向磷酸化α-突触核蛋白以及在多巴胺能神经元中普遍表达的参考蛋白的一抗。
洗涤以去除未结合的抗体。
加入针对相应一抗的荧光染料标记二抗。
再次洗涤以去除未结合的抗体。
加入DNA结合染料以染色细胞核。
使用荧光酶标仪，定量含有胞质α-突触核蛋白聚集物的多巴胺能神经元。
向每个实验孔中加入 3.75 µL 浓度为 100 µg/mL 的预先形成的纤维，向每个对照孔中加入 3.75 µL 的 PBS。
处理PFF时，需注意避免外源性蛋白质污染，操作结束后，使用1% SDS和70%乙醇清洁生物安全柜及所有与PFF相关的仪器。
在适当的实验终点，对目标标记物染色后，将96孔培养板装载到配备10倍物镜的高内涵平板扫描仪上。根据96孔板的规格（如板型、生产厂家、尺寸、孔间距离以及培养基类型和体积）调整仪器设置。
选择孔中成像区域，以覆盖每个微岛上的所有细胞，并使用一个孔根据DAPI表达调整自动对焦。根据对照孔中染色强度校准每个荧光通道的采集时间，并调整参数，使经预制纤维处理的对照孔中的多巴胺能细胞（其胞体中含有磷酸化丝氨酸129位点的α-突触核蛋白聚集物）能够被清晰区分，从而明确量化表达磷酸化丝氨酸位点α-突触核蛋白阳性与阴性的细胞。
然后，使用完全相同的参数，同时对所有选定的孔进行各通道的成像。