研究原代胚胎小鼠多巴胺神经元中的 α-突触核蛋白积累

在含有培养基的多孔板中取原代胚胎小鼠多巴胺神经元的微岛培养物。

这些神经元用预形成的原纤维 （PFF） 进行预处理，PFF 是 α-突触核蛋白的错误折叠和聚集形式。

PFF 充当种子，引发内源性 α-突触核蛋白的进一步错误折叠和寡聚化，形成磷酸化的 α-突触核蛋白原纤维。这些原纤维最终形成路易体。

固定剂代替培养基以保持细胞形态。

用缓冲液洗涤细胞。

引入含洗涤剂的缓冲液以透化细胞膜。

添加封闭溶液以防止非特异性抗体结合。

添加靶向磷酸化 α-突触核蛋白的一抗和多巴胺神经元中普遍表达的参考蛋白。

洗涤以去除未结合的抗体。

引入靶向相应一抗的荧光团偶联二抗。

再次洗涤以去除未结合的抗体。

添加 DNA 结合染料对细胞核进行染色。

使用荧光板扫描仪，量化含有细胞质α-突触核蛋白聚集体的多巴胺神经元。

每个实验孔中加入每毫升 3.75 微升 100 微克的预成型原纤维，向每个对照孔中加入 3.75 微升 PBS。

使用 PFF 时，请小心不必要的蛋白质污染，然后用 1% SDS 和 70% 乙醇清洁抽油烟机和所有 PFF 相关仪器。

在适当的实验终点，在对感兴趣的标记物进行染色后，将 96 孔培养板加载到装有 10 倍物镜的高内涵板扫描仪上。根据96孔板的规格调整设置，如板类型、制造商、尺寸、孔间距离、介质的类型和体积等。

选择孔的成像区域以覆盖每个微岛中的所有细胞，并使用一个孔调整DAPI表达的自动对焦。根据对照孔中的染色强度校准每个荧光通道的采集时间，并调整参数，使预先形成的原纤维处理的对照孔中的多巴胺细胞，在细胞体内含有磷酸丝氨酸129α突触核蛋白聚集体，被清楚地区分，从而可以明确定量磷酸丝氨酸α突触核蛋白阳性和阴性细胞。

然后，对每个孔使用完全相同的参数，同时在所有通道中对所有选定的孔进行成像。