利用光谱反射法测定固定小鼠脑切片中有髓轴突的直径

采用配备稳定激光光源的高光谱共聚焦显微镜，设置为宽光谱范围，以解析脑组织髓鞘的纳米结构。

使用参考镜采集基线反射光谱。移除参考镜后，采集暗偏移光谱以校正探测器噪声。

将带有固定脑组织切片的玻片转移至显微镜载物台上。

调整焦平面至目标组织区域，确保足够的成像深度，以尽量减少玻璃-组织界面的干扰。

将激光照射到轴突的多层髓鞘上。

当光与髓鞘相互作用时，在各层界面处会发生部分反射，由于层厚和折射率不同，从而产生干涉图样。

获取这些干涉图样的光谱图像。

在基线校正和信号分析后，反射光谱显示出波数的周期性，从而可以确定有髓神经轴突的直径。

将参考镜安装在显微镜载物台上，使镜面朝向物镜。如果难以将镜面直接放置在显微镜载物台上，可将镜面粘附于平板上。调节显微镜载物台，使焦平面与镜面重合。然后，根据探测器的动态范围调节光电倍增管（PMT）增益和激光功率。

在伪彩色下检查整个波长范围内是否存在饱和现象。如果观察到饱和，应降低激光功率。然后运行lambda扫描采集。从载物台上移除镜片，并在无样品的情况下重复相同的采集，以获得暗参考。随后，将数据保存为多层堆叠的TIFF格式。

为进行 SpeRe 图像采集，将已固定的组织置于显微镜载物台上。通过目镜使用宽场荧光模式，粗略地将组织与物镜的焦平面进行对齐。开启实时扫描后，控制显微镜载物台，使焦平面与组织中的目标区域对齐。为避免来自盖玻片的背景噪声，应从玻璃与组织交界面起，选择深度至少为 15 µm 的目标区域。

使用本视频前面演示的相同方法，获取目标区域的光谱图像堆栈。然后，将组织和暗偏移的数据以多层堆叠的TIFF格式保存。为了在ImageJ中处理图像，请打开参考镜和脑组织的光谱数据。

选择已打开图像堆栈的感兴趣区域（ROI），包括参考镜的中心区域和脑组织中的一段轴突纤维。然后，运行图像、堆栈、沿Z轴绘制轮廓图，以获取所选感兴趣区域的原始光谱。

轴突纤维在其长度方向上可能存在结构异质性，因此建议在较短的轴突节段（通常小于5微米）上选择感兴趣区域（ROI），以尽量减少部分容积伪影。

打开暗偏移数据，一份是针对参考镜获取的，另一份是针对脑组织获取的，并按照刚才演示的方法绘制z轴轮廓。然后，使用复制和粘贴功能保存所有已获取的参数。