使用光谱反射法测定固定小鼠脑切片中的有髓轴突直径

以高光谱共聚焦显微镜为例，其稳定激光源配置为宽光谱范围，以解码脑组织髓鞘纳米结构。

使用参考镜捕获基线反射光谱。取下反射镜并获取暗偏移光谱以校正探测器噪声。

带有固定脑组织切片的腔室转移到显微镜载物台。

焦平面与感兴趣的组织区域对齐，确保足够的深度以尽量减少玻璃-组织界面的干扰。

激光被引导到轴突的多层髓鞘上。

当光与髓鞘相互作用时，层界面处会发生部分反射，由于层厚度和折射率的变化而产生干涉图案。

获取这些干涉图案的光谱图像。

基线校正和信号分析后，反射率光谱揭示了波数周期性，从而可以确定有髓轴突直径。

显微镜载物台上安装参考镜，表面朝向物镜。如果将镜子放在显微镜载物台上不容易，请将镜子粘在平板上。调整显微镜载物台，使焦平面与镜面对齐。然后，考虑探测器的动态范围，调整 PMT 增益和激光功率。

在伪色下，检查整个波长范围内是否没有饱和度。如果观察到饱和度，请降低激光功率。然后，运行 lambda 扫描采集。从载物台上取下反射镜，并在没有样品的情况下重复相同的采集，以获得暗参考。然后，将数据保存为多堆栈 TIFF 格式。

要进行 SpeRe 图像采集，请将安装的组织放在显微镜载物台上。要通过目镜将组织大致对准物镜的焦平面，请使用宽场荧光模式。在实时扫描打开的情况下，控制显微镜载物台，使焦平面与组织中的感兴趣区域对齐。为避免盖玻片产生的背景噪音，请从玻璃组织界面中选择深度至少 15 微米的目标区域。

使用与本视频前面演示的相同过程获取目标区域的光谱图像堆栈。然后，以多堆叠 TIFF 格式保存组织和暗偏移的数据。要处理 ImageJ 中的图像，请打开参考镜和脑组织的光谱数据。

选择打开的图像堆栈的 ROI、参考镜的中心区域以及脑组织的轴突纤维段。然后，运行图像、堆栈、绘制 z 轴轮廓以获取所选 ROI 的原始光谱。

轴突纤维在其长度上可能在结构上是异质的，因此建议在小轴突段（通常小于 5 微米）上选择 ROI，以最大限度地减少部分体积伪影。

打开暗偏移数据，一个用于参考镜，另一个用于脑组织，并绘制刚才演示的 z 轴轮廓。然后，使用复制和粘贴选项保存所有获取的选项。