双光子显微镜监测小鼠视网膜视锥光感受器中的钙动力学

将载有膜支撑的小鼠视网膜组织的盖玻片置于双光子显微镜下。

该组织在视锥感光细胞中表达一种基于FRET的钙生物传感器。

使用水浸物镜，聚焦于组织。

在背景光照下，视锥细胞的轴突末梢保持去极化状态，从而允许钙离子内流。

细胞内钙离子结合会改变生物传感器的构象，使供体和受体荧光团相互靠近。

开始双光子成像。

显微镜的激光将低能量的近红外光聚焦到组织中。

在激光的焦点处，两个光子同时激发生物传感器，触发能量从供体向受体转移。

这会增强受体荧光，同时减弱供体荧光。

计算荧光比值。

接下来，给予光刺激以超极化视锥细胞，降低细胞内钙离子水平。

这会逆转生物传感器的构象，抑制能量从供体向受体的转移，从而降低荧光比率。

记录反应以分析光诱导的视锥细胞轴突末梢的钙动力学。

将切片从孵育室转移至记录室，并立即开始用含碳合气体的细胞外溶液灌注。保持记录室的灌注流速为 2 毫升每分钟，温度为 37 摄氏度。使用 20 倍、0.95 数值孔径的水浸物镜，结合位于记录室下方的红外 LED 和 CCD 相机，以定位视网膜切片。

按照制造商的说明启动双光子成像系统。接着，打开激光器并将其波长设置为 860 纳米。开启两个荧光检测通道，用于 ECFP 和柠檬黄荧光蛋白（citrine）的成像。然后，使用图像采集软件控制双光子显微镜进行扫描，并选择一排视锥细胞终末作为记录目标。将图像采集参数设置为 128 × 16 像素的图像或类似配置。

将扫描区域限制在视锥细胞终末，以避免视色素在外段发生漂白。打开激光器，让视锥细胞适应扫描激光和刺激背景光 20 至 30 秒，然后再施加光刺激或药理试剂。现在开始呈现任意刺激。这些刺激通过微处理器板控制定制软件，随时间调制两个 LED 的光强而生成。随后，使用相应的图像采集软件同时开始记录两个荧光通道。