双光子显微镜监测小鼠视网膜视锥细胞光感受器中的钙动力学

含有膜安装的小鼠视网膜组织的盖玻片放在双光子显微镜下。

该组织在视锥光感受器中表达基于 FRET 的钙生物传感器。

使用水浸物镜，将焦点放在组织上。

背景照明下，视锥轴突末端保持去极化，允许钙流入。

细胞内钙结合改变生物传感器的构象，使供体和受体荧光团更近。

开始双光子成像。

显微镜的激光将低能量近红外光聚焦到组织中。

在激光的焦点处，两个光子同时激发生物传感器，触发从供体到受体的能量转移。

这增加了受体荧光，同时降低了供体荧光。

计算荧光比。

接下来，提供光刺激以使视锥细胞超极化，从而降低细胞内钙水平。

这会恢复生物传感器的构象，抑制从供体到受体的能量转移并降低荧光比。

记录反应以分析视锥轴突末端中光诱发的钙动力学。

切片从保持室转移到记录室，并立即开始用碳氧合细胞外溶液灌注。记录室内的灌注流速保持每分钟 2 毫升，温度为 37 摄氏度。使用 20 倍、0.95 NA 水浸物镜和 CCD 相机与记录室下方的红外 LED 结合使用，以定位视网膜切片。

按照制造商的指示启动双光子成像系统。接下来，打开激光并将其设置为 860 纳米。打开两个检测通道，对ECFP和黄水晶进行荧光成像。接下来，使用图像采集软件，控制双光子显微镜扫描并选择一排锥形端子进行记录。将图像采集设置为 128 x 16 像素图像或类似配置。

扫描区域限制在锥形末端，以避免外段的光色素漂白。打开激光。让视锥细胞适应扫描激光和刺激背景光 20 至 30 秒，然后再提供光刺激或应用药物。现在，开始任意刺激的呈现。刺激是通过使用由定制软件控制的微处理器板随时间调制两个 LED 的强度来产生的。然后，使用相应的图像采集软件开始同时记录两个荧光通道。