使用基于细胞的神经递质荧光工程报告基因对神经递质释放进行成像

以一只带有颅窗的鼠标为例，其中包含薄薄的头骨层，以实现大脑可视化。

附带的头杆限制头部运动。

层预注射了基于细胞的神经递质荧光工程报告基因或CNiFER，CNiFER，这些报告细胞可以实时检测神经递质的释放。

CNiFER表达G蛋白偶联神经递质受体和细胞质钙检测器，该检测器由与供体和受体荧光团融合的钙结合结构域组成。

使用双光子显微镜激发检测器以引起供体荧光发射，并实现CNiFER可视化。

到达皮层的神经元活动会导致神经递质释放。

这些神经递质与 CNiFER 受体结合并激活诱导内质网释放钙的信号通路。

增加的细胞质钙与检测器结合，引起构象变化，使荧光团靠近。

供体将能量传递给受体以刺激受体荧光发射，表明神经递质释放。

部约束小鼠的成像平台放在双光子成像显微镜中的10倍水浸物镜下。插入用于品丝成像的滤光片立方体，该滤光片具有 505 纳米的二向色镜和跨度为 460 纳米至 500 纳米的带通滤光片，用于测量 ECFP，用于测量香橼

然后将ACSF添加到包含变薄颅骨窗口的孔中，并将10倍水浸物镜降低到ACSF中。将目镜与汞灯和 GFP 滤光片立方体结合使用，以定位 cNIFER。现在，切换到 40 倍水浸物镜。

接下来，选择合适的光路进行双光子成像。打开近红外飞秒脉冲激光器。选择 820 纳米的波长和 5 至 15% 的功率设置。将 PMT1 和 PMT2 电压设置为次最大值，通常为 500 至 1000 伏，具体取决于 PMT。

然后将每个通道的增益设置为 1，将物镜的 Z 位置设置为 0。将物镜降低到距皮质表面约 100 至 200 微米的位置，然后开始 x、y 扫描。调整每个通道的激光功率增益和PMT电压，以优化cNIFER荧光的信噪比。

接下来，使用该软件将成像限制在包含 cNIFER 细胞的区域以及背景区域。选择卡尔曼线平均 2 以获得合适的信噪比，并使用每像素 4 微秒时 0.3 至 1 赫兹的扫描速率。之后，在 cNIFER 细胞周围绘制 ROI，每个平面围绕大约三到四个细胞。

设置对 ROI 平均强度的实时分析。然后开始采集以监测 cNIFER 荧光随时间的变化，并在监测品丝的同时开始电刺激或行为实验。