秀丽隐杆线虫神经元中的亚细胞钙动力学成像

在带有琼脂垫的载玻片上取两个单独的转基因秀丽隐杆线虫菌株。垫子含有一种带有麻痹剂的滚动溶液，可最大限度地减少运动。

虫的腹侧神经索（VNC）包含兴奋性中间神经元，在一种菌株中表达细胞质钙指示剂，在另一种菌株中表达线粒体钙指示剂。

放置盖玻片以滚动蠕虫，定向VNC以进行可视化，然后将它们放置在荧光显微镜下。

使用可见光定位蠕虫，然后切换到荧光模式。

在静息神经元中，细胞内钙含量低使指示剂保持未结合，导致荧光微弱。

发的神经元活动打开电压门控钙通道，允许钙流入。

在具有细胞质指示剂的菌株中，钙与指示剂结合，增强细胞质荧光。

过量的细胞质钙通过通道进入线粒体。在具有线粒体指示剂的菌株中，钙结合增加线粒体荧光。

两种菌株中的神经元进行成像，以监测亚细胞钙动力学。

在13 x 100毫米的玻璃培养管中，通过将分子级琼脂溶解在M9中并微波几秒钟来制备3毫升10%琼脂。要制作琼脂垫，首先通过添加两层实验室胶带来准备两张载玻片。然后在两张载玻片之间放置显微镜载玻片。切下 1,000 微升移液器吸头的尖端，并用它将一小滴琼脂移液到盖玻片的中心。

通过向下按压琼脂顶部的另一张载玻片来压平琼脂。冷却后，使用 10 毫升管的开口将琼脂切成一个小圆盘，然后去除周围的琼脂。接下来，通过将蝇蕈醇粉末溶解在 M9 中以制备 30 毫摩尔的原液来制备蠕虫滚动溶液。用聚苯乙烯珠以一比一的比例稀释原料，制成轧制溶液。

要定位蠕虫进行成像，首先将 1.6 微升滚动溶液放在琼脂垫的中心。然后，使用首选的蠕虫镐，将所需年龄的蠕虫转移到琼脂垫上的滚动溶液中。等待大约五分钟，让蝇蕈醇减少蠕虫的运动，然后将 22 x 22 毫米的盖玻片放在琼脂垫的顶部。

对于腹侧神经索中的神经突成像，通过轻轻滑动盖玻片来滚动蠕虫。要将蠕虫安装在显微镜上，请在盖玻片上滴一滴浸油。在明场中使用低倍率物镜找到蠕虫。然后切换到 100 倍物镜，并使用 GCaMP 或 mito-GCaMP 和 488 纳米成像激光器的照明定位 AVA 神经突。