为什么零假设检验对秀丽隐杆线虫神经元的钙成像很重要？

零假设检验可确保观察到的荧光变化反映的是真实的钙离子动态，而非随机波动，从而在神经元信号传导研究中支持可靠的靶点验证。

自变量隔离如何融入亚细胞钙成像工作流程？

分离诸如指示剂类型或神经元活动状态等变量，可使研究团队将荧光变化明确归因于细胞质或线粒体的钙离子流，从而阐明其作用机制通路。

钙的定量荧光测量在检测方法开发中能够实现什么？

定量荧光输出为比较神经元反应提供了标准化且可重复的度量指标，有助于可靠地开发检测方法以及针对钙动态的化合物筛选。

为什么复制性要求对于跨功能钙成像研究至关重要？

重复实验可确保不同实验和团队间的钙流测量结果具有一致性，从而支持跨职能协作以及基于数据决策的信心。

在实施钙成像输出之前需要具备哪些统计分析能力？

需要进行稳健的统计分析，以解释荧光强度的变化，区分信号与噪声，并验证研究结果，用于后续的研发应用。

成像秀丽隐杆线虫神经元中的亚细胞钙动力学

JoVE Encyclopedia of Experiments

神经科学

0 次观看 • 3:17 分钟 • June 17th, 2025

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在载玻片的琼脂垫上分别放置两种不同的转基因秀丽隐杆线虫品系。这些琼脂垫中含有含麻痹剂的滚动溶液，可最大限度减少线虫的运动。

线虫的腹神经索（VNC）包含表达细胞质钙指示剂的一种品系和表达线粒体钙指示剂的另一种品系的兴奋性中间神经元。

将盖玻片置于线虫上使其滚动，以调整腹神经索（VNC）至可视方向，随后将其置于荧光显微镜下观察。

使用可见光定位线虫，然后切换至荧光模式。

在静息状态的神经元中，较低的细胞内钙离子浓度使指示剂保持未结合状态，从而产生微弱的荧光。

自发性神经元活动会打开电压门控钙通道，允许钙离子内流。

在含有细胞质指示剂的菌株中，钙离子与指示剂结合，增强细胞质的荧光信号。

过量的细胞质钙通过通道进入线粒体。在含有线粒体指示剂的菌株中，钙结合会增加线粒体的荧光信号。

对两种品系的神经元进行成像，以监测亚细胞钙动力学。

在一支13 × 100毫米的玻璃培养管中，将分子级琼脂溶解于M9培养基中，配制3毫升10%琼脂溶液，并微波加热数秒。制备琼脂垫时，先准备两张载玻片，在其上各贴两层实验室胶带。然后将一张显微镜载玻片置于这两张载玻片之间。剪去1,000微升移液枪吸头的尖端，用其吸取少量琼脂液滴，滴加在盖玻片中央。

通过将另一张载玻片压在琼脂表面使其变平。冷却后，使用10毫升试管的开口将琼脂切割成小圆片，然后去除周围的多余琼脂。接下来，通过将蝇蕈醇粉末溶于M9缓冲液中配制30毫摩尔的母液，以制备线虫滚动溶液。将该母液与聚苯乙烯微珠按1:1比例稀释，得到滚动工作液。

为了将线虫放置在成像位置，首先在琼脂垫中央滴加1.6 µL的滚动溶液。然后，使用合适的线虫挑取工具，将所需年龄的线虫转移至琼脂垫上的滚动溶液中。等待约五分钟，使蝇蕈醇减少线虫的运动，随后将一块22 mm × 22 mm的盖玻片盖在琼脂垫上。

为了在腹神经索中成像神经突，可轻轻滑动盖玻片使线虫翻转。将线虫装片置于显微镜下时，先在盖玻片上滴加一滴浸油。使用低倍物镜在明场下找到线虫，然后切换至100倍物镜，并利用488纳米成像激光激发GCaMP或mito-GCaMP的荧光，定位AVA神经突。