利用基于水凝胶的微柱开发微组织工程化神经网络

从一个含有微柱的培养皿开始。该微柱具有水凝胶外层和细胞外基质（ECM）内核。

向同一培养皿中加入数滴培养基。

将神经细胞团块转移至培养皿中，然后放入一个培养基液滴内。

在体视显微镜下观察，并将细胞聚集体插入微柱的两端。

然后，将已接种的微型柱转移至细胞活力培养基中。

孵育以使细胞附着于细胞外基质（ECM）。

使用体视显微镜确认细胞贴壁，然后加入培养基覆盖培养皿，并进行孵育。

附着的神经元开始通过细胞外基质延伸其轴突。

定期更换半量培养基，以维持营养水平。

随着时间的推移，轴突生长并延伸穿过整个微柱的全长，形成神经网络。

所开发的微组织工程神经网络已准备好用于重建受损的神经回路。

孵育结束后立即进行细胞接种。将约10至20微升培养基转移至含有微柱的培养皿中的两个空白区域。使用微量移液器单独收集神经元聚集体，并将其转移至含有构建物的培养皿中。用镊子将聚集体移至一处少量培养基液滴中，以维持细胞活性。

在体视显微镜下观察，使用镊子将类器官聚集体插入微柱的一端以构建单向微神经网络（micro-TENNs），或在两端分别插入以构建双向结构。随后，将接种了聚集体的微柱转移至另一小份培养基中，以避免脱水并维持聚集体的活性。待所有微柱接种完成后，在37°C、5%二氧化碳条件下孵育45分钟，使聚集体能够黏附于细胞外基质（ECM）上。

孵育后，使用体视显微镜确认聚集体仍位于微柱的末端。最后，用移液器小心地将培养基加入含有微神经组织（micro-TENNs）的培养皿中。将培养皿置于37°C、5%二氧化碳的培养箱中进行长期培养。