2.6: 细菌转化:热激法

细菌转化是一种广泛使用的方法，其中将外源 DNA 引入细菌中，然后细菌可以扩增或克隆 DNA。 能够轻松摄取这种 DNA 的细胞称为感受态细胞。 尽管许多类型的细菌都会自然发生转化，但科学家们已经找到了人工诱导和增强细菌细胞能力的方法。 在本视频中，我们将讨论其中一种方法，热休克变换。

在我们讨论热休克技术之前，让我们先讨论一下细菌转化中最常用的 DNA 类型：质粒。质粒是一种小的环状双链 DNA，可以通过超螺旋减小其大小，使其很容易穿过细胞膜上的孔。

质粒包含几个值得一提的重要区域。 市售质粒包含多克隆位点或 MCS。 该区域包含由限制性核酸内切酶或限制性内切酶识别的特定序列，它们可切割 DNA。 当质粒和 DNA 片段用相同的核酸内切酶切割时，研究人员感兴趣的 DNA 片段可以插入到多克隆位点。

质粒还包含复制起点 （ORI），它向细胞提供有关质粒复制应从何处开始的信息。

除了复制起点和多克隆位点外，大多数质粒还将包括抗生素抗性基因。该基因赋予所有含有质粒的细胞抗生素抗性，使这些细胞能够在含抗生素的培养基中存活。

现在我们已经讨论了质粒，让我们谈谈它们将被引入的细胞：感受态细胞。 分子生物学研究和转化中最常用的细菌类型是大肠杆菌，它恰好也栖息在下肠中。 细胞通常通过暴露于富含钙的环境中而获得感受态。

钙离子的正电荷中和了质粒和细菌细胞壁的负电荷，消散静电排斥并削弱细胞壁。

通过将细胞暴露在温度突然升高或热休克的环境中，细胞外部和内部之间会产生压力差，从而诱导孔的形成，超螺旋质粒 DNA 可以通过孔进入。 将细胞恢复到更正常的温度后，细胞壁会自我修复。

一旦细胞吸收了质粒，它们将能够在掺有抗生素的琼脂平板上生长。

在开始热休克改造之前，请清洁工作区域并确保所有设备都已消毒。

确保您准备好了足够的培养基和琼脂，它们为您将有能力的细菌提供营养。 另外，请务必通过高压灭菌对所有溶液进行灭菌。 使用前让液体培养基冷却至室温，让琼脂冷却至 50-55？C，可以添加抗生素和倒板的温度。 让板冷却至室温以凝固。

与细菌打交道时，应始终使用无菌技术来保持无菌。 无菌技术通常涉及使用本生灯对器械和试剂进行消毒并产生对流 ？将空气中的污染物排除在工作区之外。

在热休克反应之前，将培养基预热至室温，并将含抗生素的 LB 琼脂平板预热至 37°C。 还要确保你的水浴温度在42°C。

接下来，在冰上解冻化学感受态细胞。

添加，1-5 μL 的 1 ng/？L 冷质粒到细菌细胞中，轻轻混匀，然后将细胞和质粒混合物放回冰中 30 分钟。

时间到了，将细胞和质粒混合物置于 42？C 30 秒。

将试管从水浴中取出后立即置于冰上并加入 450？L 的媒体。 将其放入摇动培养箱中 37？C 以超过 225 rpm 的速度反应 1 小时，以便细胞能够恢复。

使用适当的无菌技术，将 20-200 μL 细菌添加到 LB 琼脂平板中，并用细菌撒布器将培养基撒布。 将板在 37 度孵育过夜？C 倒置以防止细菌接触冷凝。

第二天，摄入质粒的细菌形成菌落。

接下来，对菌落进行计数以计算转化效率，即成功转化体的数量除以铺板的 DNA 总量。

现在，可以选择菌落进行进一步实验。

在变得有能力之前，用于转化的细菌被储存在冰箱中。 它们必须在冰上解冻，铺在琼脂平板上？不使用抗生素，并在 37°C 下生长过夜。

使用无菌技术，从琼脂平板中选择一个细菌菌落，并在 37°C 的 500 ml 大培养物中过夜。C 在摇动培养箱中 ？一种防止细菌沉淀甚至营养物质在介质中扩散的工具。

当细胞生长时，制备 0.1 摩尔氯化钙和 0.1 摩尔氯化钙以及 15% 甘油溶液，高压灭菌，然后冷却。

吸光度测量用于确定细菌是否处于对数生长的中期，这意味着它们很容易吸收 DNA。 一旦细胞达到此阶段，将它们放在冰上并在整个过程中保持在那里。

接下来，将细菌细胞分成两个大离心管，并在 4°C 下旋转。倒出上清液，重悬于约 100 ml 0.1 摩尔的冷氯化钙中。然后，将细胞在冰上孵育 30 分钟。 此步骤至少重复一次。 旋转和重悬细胞的循环通常被称为洗涤细胞。

最后一次洗涤后，将细胞重悬于 50 mL 0.1 摩尔氯化钙加 15% 甘油的冷溶液中。 这些细胞现在具有化学感受态。

分发 50？L 细菌放入多个微量离心管中，并储存在 -80？C 直到准备好进行热休克。

存在许多细菌转化的应用和变体。

除了热休克之外，电击是另一种常见的转化技术。 顾名思义，电穿孔涉及使用电在细菌细胞膜上形成孔，DNA 可以通过该孔。

关于转化细菌的筛选，质粒通常包含编码 β-半乳糖苷酶的基因，以帮助筛选。 当这种酶的底物包含在琼脂平板中时，用含有插入片段的质粒转化的细菌产生白色菌落，而那些没有的细菌产生蓝色菌落。 这种方法称为蓝白屏蔽。

在大多数转化实验中，目标是让快速分裂的细菌产生大量质粒，其中包括您的靶基因。 细菌转化后，下一步是在含抗生素的液体培养基中培养大量细菌并进行质粒纯化，顾名思义，这涉及从细菌中纯化质粒。 许多商业试剂盒可用于此目的。

有时转化的目标是让细菌产生大量由质粒编码的蛋白质。在这里，您可以看到细菌细胞被匀浆和裂解，然后才能进行一种称为亲和纯化的技术来分离靶蛋白。纯化大量蛋白质后，可以将其结晶并识别目标特定蛋白质的结构。

您刚刚观看了 JoVE 热休克变换简介。在本视频中，我们回顾了：什么是热休克转化及其工作原理，其背后的原理以及如何成功转化细菌。 感谢观看！