Question 1

什么是质粒，为什么它被用于细菌转化？

Accepted Answer

质粒是一种小型的、圆形的、染色体外的DNA片段，它作为载体将你特定的DNA序列带入细菌细胞。它包含一个多重克隆位点，用于限制酶插入你的目标基因，一个用于DNA复制的复制起点，以及一个使转化的细菌能在含抗生素的培养基上存活的抗生素抗性基因。

Question 2

电穿孔如何在细菌细胞膜中创建孔洞？

Accepted Answer

电穿孔在毫秒内施加每厘米1,000到10,000伏特的高压电场，使膜电压达到0.5-1伏特。这会重新排列磷脂双层，形成暂时的孔洞，通过它们质粒DNA通过。一旦脉冲停止，双层会自我修复，将DNA困在细胞内部。

Question 3

什么是电能感受性细胞，它们如何准备？

Accepted Answer

电转化能胜细胞是在电穿孔过程中随时准备吸收DNA的细菌。大肠杆菌细胞被培养到中对数期，然后在去离子水和10%甘油溶液中多次洗涤以去除盐。去除盐非常关键，因为高盐含量会导致电弧，这是一种电放电现象，会杀死细胞并表明转化失败。

Question 4

为什么时间常数在预测电穿孔成功中很重要？

Accepted Answer

时间常数测量的是在电脉冲施加后电压衰减的速度。对于细菌来说，良好的时间常数范围是5-10毫秒。快速衰减表明盐浓度高，会导致电弧和细胞死亡。监测时间常数有助于在观察菌落生长之前预测您的转化是否会成功。

Question 5

电穿孔与热休克转化相比如何？

Accepted Answer

热休克转化使用氯化钙和热暴露代替电脉冲，对细菌更温和且比电穿孔更便宜。然而，热休克产生较低的转化效率，需要更长时间，且仅适用于细菌、酵母和植物质原体。电穿孔通过一种称为转染的过程实现更高的效率，并适用于 哺乳动物细胞。

Question 6

电穿孔后，有哪些步骤可以识别成功转化的细菌？

Accepted Answer

脉冲后，向细胞中加入恢复培养基，并在37°C下振荡孵育1小时。将细胞在含有抗生素的琼脂上平板培养，并在37°C下过夜孵育。只有成功摄取质粒的细菌能在抗生素中存活。计数形成的菌落，并通过将成功转化体数量除以平板上的总DNA量来计算转化效率。

Question 7

电穿孔除了用于细菌转化之外，还有哪些应用？

Accepted Answer

电穿孔适用于哺乳动物细胞通过转染，使用的场强比细菌细胞低，但时间常数较长。科学家还在整个生物体中使用电穿孔，例如在发育中的鸡胚中，通过将质粒DNA注射到大脑组织中并施加电场。这允许观察发光蛋白表达和发育中神经组织的结构变化。

细菌转化:电穿孔法 - 评估测验