2.8: 酶联免疫吸附测定法

ELISA 或酶联免疫吸附测定法是一种广泛使用的方法，用于确定是否存在特定靶蛋白。

通过一系列洗涤和结合步骤，与酶偶联或连接的抗体将识别 96 孔板底部的靶蛋白。当底物添加到样品中时，会发生酶促反应，导致颜色变化，从而可以识别和定量目标蛋白质。

在我们讨论如何进行 ELISA 之前，让我们先熟悉一下您需要的设备和试剂。

ELISA 反应的设置通常为 96 孔平底板。孔的平底将有助于促进实验样品以及捕获和检测抗体的均匀分布。

ELISA 可检测实验水溶液中是否存在特异性靶蛋白。尿液、细胞培养基和血清是常见的实验样品。

在 ELISA 中，直接与靶蛋白结合的抗体是一抗。它具有高亲和力，即对目标蛋白的表位（特定区域）紧密结合的高能力。一抗通常是未标记或未偶联的。

如前所述，抗体主要通过与特定表位的高亲和力结合来结合其靶蛋白。但是，实验样品可能包含表达非特异性结合位点的细胞片段，这些位点可以结合检测抗体的恒定或非表位特异性区域。

因此，在 ELISA 中添加封闭缓冲液对于覆盖实验样品中的任何非特异性结合位点至关重要。否则，您可能会在不含靶蛋白的孔中发生酶促反应，从而获得假阳性数据！

ELISA 中的二抗是用于识别一抗的抗体。该抗体通常与酶偶联。有时二抗有一个时髦的名字。例如，如果在驴中制备或饲养二抗以识别在山羊中饲养的一抗，则该二抗将称为驴抗山羊抗体。 在命名二抗时，第一个名称表示产生二抗的生物体，第二个名称表示产生一抗的生物体。

还需要与与二抗相连的酶的活性位点结合的底物。在此反应过程中发生的化学反应会导致原本无色的基材发生颜色变化。这种所谓的比色测定可以识别和定量靶蛋白的存在。

只要有可用的底物，酶促反应就会继续。因此，在短暂的孵育期后，向孔中加入终止溶液，这会导致另一个颜色变化，表明反应实际上已停止。

将使用酶标仪通过读取每个孔中的吸光度（即有色产物的量）来量化每个孔中目标蛋白质的浓度。吸光度与存在的靶蛋白的量成正比。

现在您已经准备好了所有设备，让我们运行 ELISA！

要进行标准或直接 ELISA，首先用用包被缓冲液稀释的目标靶蛋白包被 96 孔板的孔。此时也要接种阳性和阴性对照。

在孵育包被板足够长的时间以使蛋白质有时间完全吸附或附着到板底部后，快速轻弹手腕即可倒掉多余的包被溶液。

然后通过在封闭缓冲液中孵育每个孔来阻断任何可能的非特异性结合或背景信号。

现在倾倒封闭缓冲液，并在磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 和 1% BSA 中短暂室温孵育洗涤孔。

在用 PBS 冲洗孔时，制备已知浓度的靶蛋白的稀释液以创建标准曲线。标准曲线孔（包含已知浓度的目标蛋白）的吸光度将用于根据样品孔的吸光度与标准曲线孔的吸光度的比较来计算实验样品孔中目标蛋白的浓度。

现在是时候添加检测或一抗了！

然后将板通常在室温下孵育，以允许足够量的抗体与靶蛋白结合，以便稍后检测和定量蛋白质。

孵育后，去除多余的抗体，并用 PBS 短暂洗涤孔。

然后将二抗添加到板中，并再次孵育板 ？通常在旋转平台上？以允许二抗结合。 像以前一样重复洗涤步骤。

接下来，将底物添加到板中，以查看哪些孔包含您的靶蛋白。盖上板以保护反应避光，然后在短暂孵育后，用终止液终止反应。

最后，将板放入酶标仪中，以测量每个孔中的吸光度或有色溶液的量。您需要选择希望读者分析的井。当仪器完成对板的读取后，将显示每个孔的吸光度读数。

需要注意的是，每个 ELISA 试剂盒都有一个检测限。也就是说，只有高于和低于特定限度的蛋白质浓度才能准确测定。非常低浓度的蛋白质通常太接近非特异性染色的背景水平，而非常高的浓度可能表明过量的蛋白质或抗体没有在该样品孔中被正确洗掉。

那么，为什么要进行 ELISA 呢？让我们看一下一些常见的应用程序。

最常见的 ELISA 类型可能是夹心 ELISA。

在夹心 ELISA 中，首先在 96 孔板中包被识别目标靶蛋白的一抗。

在本实验中，通过自动化系统将从产生人抗体的细胞系中收获的细胞培养基接种到预包被有可识别人抗体的一抗的 96 孔板上。

用 PBS 洗去多余的样品后，加入酶联二抗，然后加入比色底物。

然后以与典型 ELISA 相同的方式测量吸光度。例如，在本实验中，此 ELISA 数据将用于确定哪些细胞系产生对 ？那是准确绑定到 的最佳能力 ？其靶抗原。

非处方妊娠试验是夹心 ELISA 的一种类型。

当潜在孕妇的尿液被添加到测试中时，附着在测试上的酶联一抗将结合妊娠激素 hCG（如果存在）。如果女性怀孕，当一抗在测试部位被底物结合的二抗识别时，将发生底物-enyzme 反应，并出现一条彩色线条。

另一种类型的 ELISA 是竞争性 ELISA，可用于检测抗体的存在。

如果样品中存在目标抗体，它们将与附着在板底部的靶蛋白结合。稍后，当酶联检测抗体添加到板中时，酶联抗体将发现很少或没有蛋白质可结合;他们将会被 "胜出"通过实验样品中感兴趣的抗体。

那么，在竞争性 ELISA 中，彩色孔表示实际上不包含目标抗体的样品！患者血浆样本通常在竞争性 ELISA 中运行，以确定样本中是否存在针对某些病原体（如 HIV 病毒）的抗体。

您刚刚观看了 JoVE 对执行 ELISA 的介绍。 在本视频中，我们回顾了：什么是 ELISA 及其工作原理;您需要进行哪些设备和试剂以及 ELISA;以及该测定的一些不同应用。感谢您的观看，并记住不要让您的基材过度发展！